Isolamento e caracterização de modelos organóides de adenocarcinoma ductatopansa pâncreas derivados do paciente
Summary
Culturas organóides derivadas do paciente de adenocarcinoma ductal pancreático são um modelo tridimensional rapidamente estabelecido que representa compartimentos de células tumorais epiteliais com alta fidelidade, permitindo a pesquisa translacional sobre essa malignidade letal. Aqui, fornecemos métodos detalhados para estabelecer e propagar organóides, bem como para realizar ensaios biológicos relevantes usando esses modelos.
Abstract
O adenocarcinoma ductal pancreatic (PDAC) está entre as malignidades as mais letais. Recentemente, métodos de cultura organóide de última geração que permitem a modelagem tridimensional (3D) desta doença foram descritos. Os modelos organóides (DOP) derivados do paciente podem ser isolados de espécimes cirúrgicos, bem como de pequenas biópsias e se formar rapidamente na cultura. É importante ressaltar que os modelos organóides preservam as alterações genéticas patogênicas detectadas no tumor do paciente e são preditivos da resposta ao tratamento do paciente, possibilitando estudos translacionais. Aqui, fornecemos protocolos abrangentes para adaptar o fluxo de trabalho da cultura do tecido para estudar modelos organóides em 3D, matriz embutida. Detalhamos métodos e considerações para isolar e propagar organóides PDAC primários. Além disso, descrevemos como a mídia organóide medida é preparada e a qualidade controlada em laboratório. Finalmente, descrevemos ensaios para caracterização a jusante dos modelos organóides, como isolamento de ácidos nucleicos (DNA e RNA) e testes de drogas. É importante ressaltar que fornecemos considerações críticas para a implementação da metodologia organóide em um laboratório de pesquisa.
Introduction
O adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é uma doença letal caracterizada pelo diagnóstico tardio na maioria dos pacientes, a falta de terapias eficazes e uma baixa taxa de sobrevida global resultante de 5 anos que permanece inferior a 10%1. Apenas 20% dos pacientes são diagnosticados com uma doença localizada adequada para intervenção cirúrgica curativa2,3. Os pacientes restantes são tratados tipicamente com uma combinação de agentes quimioterápicos que são eficazes em uma minoria dos pacientes4,5. Para atender a essas necessidades clínicas prementes, os pesquisadores estão trabalhando ativamente em estratégias de detecção precoce e no desenvolvimento de terapias mais eficazes. Para acelerar a tradução clínica de descobertas importantes, os cientistas estão empregando modelos de camundongos geneticamente modificados, xenoenxertos derivados de pacientes, linhas de células monocamadas e, mais recentemente, modelos organóides6.
A cultura epiteliana tridimensional do organóide do epitelida usando o fator de crescimento e as condições ricas do Wnt-ligand para estimular a proliferação de pilhas untransformed do progenitor foi descrita primeiramente para o intestino7 do rato e foi adaptada rapidamente ao tecido pancreatic humano normal8. Além do tecido ductal normal, a metodologia organóide permite o isolamento, expansão e estudo do PDAC humano8. Importante, o método suporta o estabelecimento dos organoids dos espécimes cirúrgicos, assim como biópsias finas e do núcleo da agulha, permitindo que os investigadores estudem todos os estágios da doença9,10. Curiosamente, organóides derivados do paciente recapitulam subtipos transcritormicos tumorais bem descritos e podem permitir o desenvolvimento de plataformas de medicina de precisão9,11.
Os protocolos organóides atuais para PDAC permitem a expansão bem-sucedida de mais de 70% das amostras de pacientes de pacientes quimio-ingênuos9. Aqui apresentamos os métodos padrão empregados pelo nosso laboratório para isolar, expandir e caracterizar organóides PDAC derivados do paciente. Outras metodologias organóides do PDAC foram descritas12,13, mas nenhuma comparação desses métodos foi realizada minuciosamente. Como essa tecnologia é relativamente nova e avança rapidamente, esperamos que esses protocolos continuem a evoluir e melhorar; no entanto, os princípios do manuseio de tecidos e da cultura organóide continuarão a ser úteis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, apresentamos protocolos atuais para isolar, expandir e caracterizar organóides PDAC derivados do paciente. Nossa taxa de sucesso atual de estabelecer a cultura organóide é superior a 70%; Portanto, esses métodos ainda não foram aperfeiçoados e espera-se que melhorem e evoluam ao longo do tempo. Deve ser dada uma consideração importante ao tamanho da amostra, pois o PDAC tem uma baixa celularidade neoplástica. Consequentemente, pequenos espécimes conterão poucas células tumorais e gerarão apenas um punh…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos pelo apoio da UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, membros do laboratório Lowy e do Departamento de Cirurgia da UC San Diego, Divisão de Oncologia Cirúrgica. A AML é generosamente apoiada pelo NIH CA155620, um Prêmio de Sonho de Câncer de Câncer Pancreático da Fundação SU2C CRUK Lustgarten (SU2C-AACR-DT-20-16) e doadores do Fundo para Curar o Câncer Pancreático.
Materials
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
Referencias
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