환자 유래 췌장 선암 조직형 모델의 격리 및 특성 분석
Summary
췌장 덕트 선암의 환자 유래 오르가노이드 배양은 높은 충실도를 가진 상피 종양 세포 구획을 나타내는 급속하게 확립된 3차원 모형, 이 치명적인 악성에 번역 연구를 가능하게 합니다. 여기에서, 우리는 이 모형을 사용하여 관련 생물학 생물학 생물학 적인 생물학 적인 생물학 적인 생물학 적인 생물학 을 능력을 발휘하기 위하여 오르가노이드를 설치하고 전파하기 위하여 상세한 방법을 제공합니다.
Abstract
췌장 덕트 선암 (PDAC)은 가장 치명적인 악성 종양 사이에 있습니다. 최근에는 이 질병의 3차원(3D) 모델링을 가능하게 하는 차세대 오르가노이드 배양 방법이 기술되고 있다. 환자 유래 오르가노이드(PDO) 모델은 수술 표본뿐만 아니라 작은 생검에서 분리될 수 있으며 배양에서 빠르게 형성될 수 있다. 중요한 것은, organoid 모형은 환자의 종양에서 검출된 병원성 유전 변경을 보존하고 환자의 처리 반응의 예측, 따라서 번역 연구를 가능하게 합니다. 여기서, 우리는 3D, 매트릭스 임베디드, 오르가노이드 모델을 연구하기 위해 조직 배양 워크플로우를 적응시키기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다. 우리는 1 차적인 PDAC 오르가노이드를 격리하고 전파하기 위한 방법 그리고 고려사항을 상세히 설명합니다. 또한 맞춤형 오르가노이드 미디어가 실험실에서 어떻게 준비되고 품질이 조절되는지 설명합니다. 마지막으로, 우리는 핵산 (DNA와 RNA)의 격리와 같은 오르가노이드 모형의 하류 특성화를 위한 실험 (DNA와 RNA), 및 약 시험을 기술합니다. 중요한 것은 우리는 연구 실험실에서 유기적 방법론을 구현하기위한 중요한 고려 사항을 제공합니다.
Introduction
췌장 덕트 선암(PDAC)은 대부분의 환자에서 늦은 진단, 효과적인 치료법의 부족, 그리고 10% 미만으로 남아 있는 5년 전체 생존율이 낮은 치명적인질환이다. 환자의 20%만이 치료외과적 개입에 적합한 국부성 질환으로 진단된다2,3. 나머지 환자는 전형적으로 소수의 환자4,5에서효과적인 화학치료제의 조합으로 치료된다. 이러한 긴급한 임상 적 요구를 해결하기 위해 연구자들은 조기 발견 전략과 보다 효과적인 치료법 개발에 적극적으로 노력하고 있습니다. 중요한 발견의 임상 번역을 가속화하기 위하여는, 과학자는 유전으로 조작한 마우스 모형, 참을성 있는 파생된 이종이식, 단층 세포 선 및, 가장 최근에, organoid 모형6를채택하고 있습니다.
변형되지 않은 전구세포의 증식을 자극하는 성장인자 및 Wnt-리간드를 이용한 3차원 상피 오르가노이드 배양은 마우스장(7)에 대해 최초로 기술되었고 정상 인간 췌장 조직에 신속하게 적응시켰다8. 일반적인 덕트 조직 이외에, organoid 방법론은 인간 PDAC8의격리, 확장 및 연구를 허용합니다. 중요한 것은, 이 방법은 수술 표본에서 오르가노이드의 확립뿐만 아니라 미세 및 코어 바늘 생검을 지원하여 연구원이 질병의 모든 단계를 연구 할 수있도록9,10. 흥미롭게도, 환자 유래 오르가노이드는 잘 기재된 종양 전사체 아류형을 재입증하고 정밀 의학 플랫폼9,11의개발을 가능하게 할 수 있다.
PDAC를 위한 현재 organoid 프로토콜은 화학 순진한 환자에게서 참을성 있는 견본의 70% 이상 의 성공적인 확장을 가능하게합니다 9. 여기에서 우리는 환자 유래 PDAC 오르가노이드를 분리, 확장 및 특성화하기 위해 실험실에서 사용하는 표준 방법을 제시합니다. 다른 PDAC 조직적 방법론은12,13에 기술되었지만 이들 방법의 비교는 철저히 수행되지 않았다. 이 기술은 비교적 새롭고 빠르게 발전하기 때문에 이러한 프로토콜은 계속 진화하고 개선될 것으로 기대합니다. 그러나 조직 취급 및 오르가노이드 문화의 원리는 계속 유용할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 환자 유래 PDAC 오르가노이드를 분리, 확장 및 특성화하기 위한 현재 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 문화를 확립하는 우리의 현재 성공률은 70 % 이상입니다; 따라서 이러한 방법은 아직 완성되지 않았으며 시간이 지남에 따라 개선되고 진화할 것으로 예상됩니다. PDAC는 낮은 신생물 세포성을 가지고 있기 때문에 샘플 크기에 중요한 고려 사항을 주어야합니다. 따라서, 작은 견본…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 UC 샌디에고 무어 암 센터 생물 저장소 및 조직 기술 공유 자원의 지원에 감사드립니다, 로위 실험실의 구성원, 수술의 UC 샌디에고 부서, 외과 종양학의 부문. AML은 NIH CA155620, SU2C CRUK 루스트가르텐 재단 췌장암 드림 팀 상(SU2C-AACR-DT-20-16)과 췌장암 치료 기금에 대한 기부자들의 후원을 받고 있습니다.
Materials
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
Referencias
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