患者衍生胰腺腺腺腺腺癌有机体模型的分离和特征
Summary
胰腺导管腺癌患者衍生的有机体培养是一种快速建立的三维模型，代表高保真度的上皮肿瘤细胞室，从而能够对这种致命的恶性肿瘤进行转化研究。在这里，我们提供详细的方法来建立和传播有机体，以及使用这些模型执行相关的生物测定。
Abstract
胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的恶性肿瘤之一。最近，介绍了支持该疾病的三维（3D）建模的下一代有机体培养方法。患者衍生的有机体 （PDO） 模型可以从手术标本和小活检中分离出来，并在培养中快速形成。重要的是，有机体模型保存了在患者肿瘤中检测到的致病基因改变，并预测患者的治疗反应，从而支持转化研究。在这里，我们提供用于调整组织培养工作流程以研究3D、基体嵌入式、有机体模型的全面协议。我们详细介绍了隔离和传播初级 PDAC 有机体的方法和注意事项。此外，我们描述了在实验室中如何制备定制有机物介质并控制质量。最后，我们描述了有机体模型的下游表征的测定方法，如核酸分离（DNA和RNA）和药物测试。重要的是，我们为在研究实验室中实施有机体方法提供了重要的考虑因素。
Introduction
胰腺导管腺癌（PDAC）是一种致命的疾病，大多数患者诊断较晚，缺乏有效的治疗方法，导致5年总存活率较低，仍然低于10%1。只有20%的患者被诊断为局部疾病，适合治疗手术干预2，3。其余患者通常使用化疗剂的组合进行治疗，这些药物对少数患者有效4，5。为了满足这些紧迫的临床需求，研究人员正在积极研究早期发现策略和开发更有效的疗法。为了加速重要发现的临床翻译，科学家们正在采用基因工程小鼠模型、患者衍生异种移植物、单层细胞系，以及最近6个有机体模型。
利用生长因子和Wnt-ligand丰富条件刺激未转化祖细胞增殖的三维上皮有机体培养首先为小鼠肠道7进行了描述，并很快适应了正常的人类胰腺组织8。除了正常的导管组织，有机体方法允许分离，扩大和研究人类PDAC8。重要的是，该方法支持建立从手术标本，以及精细和核心针活检，使研究人员研究疾病的所有阶段9，10。有趣的是，患者衍生的有机物重述了描述良好的肿瘤转录组子型，并可能支持开发精密医学平台9，11。
目前PDAC的有机体方案使超过70%的患者样本成功地从化疗患者9中扩展。在这里，我们介绍了我们的实验室用于分离、扩展和表征患者衍生的PDAC有机体的标准方法。其他PDAC有机体方法已被描述12，13，但没有对这些方法进行比较。由于这项技术相对较新且发展迅速，我们预计这些协议将继续改进和改进;然而，组织处理和有机体培养的原则将继续有用。
Protocol
所有用于研究的人体组织收集都经过内部审查委员会 （IRB） 的审查和批准。在哺乳动物组织培养实验室环境中，以下所有协议均在无菌条件下执行。 1. 媒体准备 有条件的介质准备。注：人体胰腺有机体培养物需要丰富的生长因子和营养，以及条件性介质补充，为器官扩张提供足够的生长刺激。下面描述的两种条件介质都是从市售的细胞系制备的（见材料表<…
Representative Results
为了说明与从PDAC分离有机体相关的挑战，我们展示了从小低细胞肿瘤样本中建立患者衍生的有机体培养物。初始电镀后，每口井只可以看到几个有机物，如图1所示。有机体被允许在2周内变大，并根据我们的协议通过，以建立一个更强大的文化，如早期和后期段落1代表性图片（图1）。需要注意的是，在晚期原体分离物中观察到的较大的囊性有机体在?…
Discussion
在这里，我们提出用于隔离、扩展和描述患者衍生的PDAC有机体的当前方案。目前，我国建立有机体栽培的成功率超过70%;因此，这些方法尚未完善，并有望随着时间的推移而改进和发展。应重视样本大小，因为PDAC具有低肿瘤细胞性。因此，小标本将包含很少的肿瘤细胞，并且只会产生少量的有机物。此外，许多患者在手术干预15之前接受化疗和/或化疗为基础的新辅助治疗。如果?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢加州大学圣地亚哥摩尔斯癌症中心生物储存和组织技术共享资源，洛伊实验室的成员，以及加州大学圣地亚哥外科部，外科肿瘤科的支持。AML 得到 NIH CA155620、SU2C CRUK 卢斯特加滕基金会胰腺癌梦团队奖（SU2C-AACR-DT-20-16）的慷慨支持，以及治疗胰腺癌基金的捐赠者。
Materials
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
Referencias
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Citar este artículo
Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. J. Vis. Exp. (155), e60364, doi:10.3791/60364 (2020).