Isolamento e caratterizzazione dei modelli organoidi dell'adenocarcinoma duttale pancreatico derivato dal paziente

Summary

Le colture organoidi derivate dal paziente dell’adenocarcinoma duttale pancreatico sono un modello tridimensionale rapidamente stabilito che rappresenta i compartimenti delle cellule tumorali epiteliali con alta fedeltà, consentendo la ricerca traslazionale in questa malignità letale. Qui, forniamo metodi dettagliati per stabilire e propagare gli organoidi, nonché per eseguire saggi biologici pertinenti utilizzando questi modelli.

Abstract

L’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è tra le neoplasie più letali. Recentemente, sono stati descritti metodi di coltura organoide di nuova generazione che consentono la modellazione tridimensionale (3D) di questa malattia. I modelli organoidi (PDO) derivati dal paziente possono essere isolati sia da campioni chirurgici che da piccole biopsie e si formano rapidamente nella coltura. È importante sottolineare che i modelli organoidi conservano le alterazioni genetiche patogene rilevate nel tumore del paziente e sono predittivi della risposta al trattamento del paziente, consentendo così studi traslazionali. Qui, forniamo protocolli completi per adattare il flusso di lavoro della coltura tissutale per studiare modelli 3D, a matrice incorporata e organoidi. Vengono descritti in dettaglio i metodi e le considerazioni per l’isolamento e la propagazione degli organoid PDAC primari. Inoltre, descriviamo come i supporti organoidi su misura sono preparati e la qualità controllata in laboratorio. Infine, descriviamo i saggi per la caratterizzazione a valle dei modelli organoidi come l’isolamento degli acidi nucleici (DNA e RNA) e il test farmacologico. È importante sottolineare che forniamo considerazioni critiche per l’implementazione della metodologia organoide in un laboratorio di ricerca.

Introduction

L’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è una malattia letale caratterizzata da diagnosi tardiva nella maggior parte dei pazienti, mancanza di terapie efficaci e un basso tasso di sopravvivenza globale a 5 anni che rimane inferiore al 10%¹. Solo il 20% dei pazienti viene diagnosticato con una malattia localizzata adatta per l’intervento chirurgico curativo^2,3. I restanti pazienti sono tipicamente trattati con una combinazione di agenti chemioterapici che sono efficaci in una minoranza di pazienti^4,5. Per rispondere a queste pressanti esigenze cliniche, i ricercatori stanno lavorando attivamente su strategie di diagnosi precoce e sullo sviluppo di terapie più efficaci. Per accelerare la traduzione clinica di importanti scoperte, gli scienziati stanno impiegando modelli murini geneticamente ingegnerizzati, xenotrapianto derivati dal paziente, linee di cellule monostrato e, più recentemente, modelli organoidi⁶.

La coltura organoide epiteliale tridimensionale utilizzando il fattore di crescita e le ricche condizioni Wnt-ligand per stimolare la proliferazione delle cellule progenitrici non trasformate sono state descritte per la prima volta per l’intestino del topo⁷ e sono state rapidamente adattate al normale tessuto pancreatico umano⁸. Oltre al normale tessuto duttale, la metodologia organoide consente l’isolamento, l’espansione e lo studio del PDAC⁸umano. È importante sottolineare che il metodo supporta la creazione di organoidi da campioni chirurgici, così come biopsie di aghi fini e core, permettendo ai ricercatori di studiare tutte le fasi della malattia^9,10. È interessante notare che gli organoidi derivati dal paziente riassumono sottotipi trascrittomici tumorali ben descritti e possono consentire lo sviluppo di piattaforme di medicina di precisione^9,11.

Gli attuali protocolli organoidi per il PDAC consentono il successo dell’espansione di oltre il 70% dei campioni di pazienti da pazienti chemio-naive⁹. Qui presentiamo i metodi standard impiegati dal nostro laboratorio per isolare, espandere e caratterizzare gli organoidi PDAC derivati dal paziente. Altre metodologie organoidi PDAC sono state descritte^12,13 ma nessun confronto di questi metodi è stato accuratamente eseguito. Poiché questa tecnologia è relativamente nuova e avanza rapidamente, prevediamo che questi protocolli continueranno ad evolversi e migliorare; tuttavia i principi della manipolazione dei tessuti e della coltura organoide continueranno ad essere utili.

Protocol

Tutta la raccolta di tessuti umani per uso di ricerca è stata rivista e approvata dal nostro Internal Review Board (IRB). Tutti i seguenti protocolli vengono eseguiti in condizioni asettiche in un ambiente di laboratorio di coltura dei tessuti mammiferi. 1. Preparazione dei supporti Preparazione dei supporti condizionati.NOTA: I supporti organoidi pancreatici umani richiedono abbondanti fattori di crescita e sostanze nutritive, nonché il completamento dei supporti condizionati …

Representative Results

Per illustrare le sfide associate all’isolamento degli organoidi dal PDAC, mostriamo la creazione di una coltura organoide derivata dal paziente da un piccolo campione di tumore ipocellulare. Dopo la placcatura iniziale, solo pochi organoidi erano visibili per bene, come mostrato Figura 1. Gli organiidi sono stati autorizzati a crescere più grande nel corso della durata di 2 settimane e sono stati passaggi secondo il nostro protocollo per stabilire una cultura più robusta, come mostrato ne…

Discussion

Qui presentiamo i protocolli attuali per isolare, espandere e caratterizzare gli organoidi PDAC derivati dal paziente. Il nostro attuale tasso di successo nell’stabilire la cultura organoide è superiore al 70%; pertanto, questi metodi non sono ancora stati perfezionati e si prevede che miglioreranno ed evolvono nel tempo. Si dovrebbe considerare importante la dimensione del campione, in quanto il PDAC ha una bassa cellularità neoplastica. Di conseguenza, piccoli esemplari conterranno poche cellule tumorali e genererann…

Materials

12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips
12 well plates	Olympus	25-106
15 ml LoBind conical tubes	Eppendorf	EP0030122208
15 ml tube Rotator and/or nutator
37 °C CO2 incubator
37 °C water bath
384 well plates	Corning	4588	Ultra low attachment, black and optically clear
A 83-01	TOCRIS	2939
ADV DMEM	ThermoFisher	12634010
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Automated cell counter
B27 supplement	ThermoFisher	17504044
Cell Recovery Solution	Corning	354253	Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C
CellTiterGlow	Promega	G7570	Luminescence cell viability reagent
Chloroform	Sigma	C2432
Computer
CryoStor CS10	StemCELL Tech	07930	Cell Freezing Solution
Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells	Trevigen	3710-001-K
DMEM	ATCC	30-2002
DNase I	Sigma	D5025
Drug printer	Tecan	D300e	This is the drug printer we use in our laboratory
Excel			For data analysis
Extra Fine Graefe Forceps	Fine Science Tools	11150-10
FBS	ThermoFisher	16000044
G-418	ThermoFisher	10131035
Gastrin I (human)	TOCRIS	3006
Gentle Collagenase/hyaluronidase	STEMCELL Tech	7919
GlutaMAX	ThermoFisher	35050061	Glutamine solution
GraphPad Prism			For data analysis
HEPES	ThermoFisher	15140122
Laminar flow tissue culture hood
Luminometer
L-Wnt-3A expressing cells	ATCC	CRL-2647
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi biotec	130-100-008
Matrigel Matrix	Corning	356230	Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced
Mr. Frosty Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165
Nicotinamide	Sigma	N0636
p1000 pipette with tips
p200 pipette with tips
PBS	ThermoFisher	10010049
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher	15630080
primocin	InvivoGen	ant-pm-2
Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm)	ThermoFisher	121-0020
Recombinant Human FGF-10	Peprotech	100-26
Recombinant Murine Noggin	Peprotech	250-38
Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade	VWR	89176-380
Tissue culture centrifuge
Tissue Culture Dishes 10 cm	Olympus	25-202
TRIZol	ThermoFisher	15596018	Acid Phenol solution
TrypLE Express	ThermoFisher	12605010
Y-27632	Sigma	Y0503
Zeocin	ThermoFisher	R25001