Sequenzierung kleiner nicht-kodierender RNA aus formalinfixierten Geweben und Serum-abgeleiteten Exosomen von kastrationsresistenten Prostatakrebspatienten

Summary

Therapieresistenz entwickelt sich oft bei Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs, und in einigen Fällen entwickelt sich Krebs zu einem tödlichen Subtyp namens neuroendokrine minale Prostatakrebs. Die Bewertung der kleinen nicht-kodierenden RNA-vermittelten molekularen Veränderungen, die diesen Übergang erleichtern, würde eine bessere Krankheitsschichtung und Identifizierung von kausalen Mechanismen ermöglichen, die zur Entwicklung von neuroendokrinem Prostatakrebs führen.

Abstract

Ablation von Androgen-Rezeptor (AR) Signalisierung durch Androgen-Entzug ist das Ziel der ersten Linie der Therapie für Prostatakrebs, die zunächst in Krebs Regression führt. In einer signifikanten Anzahl von Fällen entwickelt sich die Krankheit jedoch zu fortgeschrittenem, kastrationsresistentem Prostatakrebs (CRPC), der nur begrenzte therapeutische Möglichkeiten hat und oft aggressiv ist. Entfernte Metastasen werden meist in diesem Stadium der aggressiven Krankheit beobachtet. CRPC wird von einer zweiten Generation von AR-Signalweg-Inhibitoren behandelt, die das Überleben zunächst verbessern, gefolgt von der Entstehung von Therapieresistenz. Neuroendokrine Prostatakrebs (NEPC) ist eine seltene Variante von Prostatakrebs (PCa), die sich oft als Folge der Therapieresistenz über einen Transdifferenzierungsprozess entwickelt, der als neuroendokrine Differenzierung (NED) bekannt ist, wobei PCa-Zellen einem Abstammungsschalter unterzogen werden. von Adenokarzinomen und zeigen eine erhöhte Expression von neuroendokrinen (NE) Linienmarkern. Neben den genomischen Veränderungen, die das Fortschreiten und die Transdifferenzierung zu NEPC vorantreiben, werden epigenetische Faktoren und mikroökologische Hinweise als wesentliche Akteure bei der Förderung der Krankheitsprogression angesehen. Dieses Manuskript enthält ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung der epigenetischen Treiber (d. h. kleine nicht-kodierende RNAs), die mit fortgeschrittenen PCa in Verbindung stehen. Mit gereinigten microRNAs aus formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) metastasierenden Geweben und entsprechenden serumabgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) beschreibt das Protokoll, wie Bibliotheken mit entsprechender Qualitätskontrolle für die Sequenzierung vorbereitet werden. microRNAs aus diesen Probenquellen. Die Isolierung von RNA sowohl aus FFPE als auch von EVs ist oft eine Herausforderung, da der größte Teil davon entweder abgebaut oder quantitativ begrenzt ist. Dieses Protokoll wird verschiedene Methoden zur Optimierung der RNA-Eingänge und cDNA-Bibliotheken erarbeiten, um bei der Sequenzierung die meisten spezifischen Lesevorgänge und qualitativ hochwertigen Daten zu liefern.

Introduction

Prostatakrebs wird durch Androgene angetrieben, die über AR-Signale wirken. Daher ist die Ausrichtung auf den AR-Signalweg die Hauptstütze der Krankheit¹. Jedoch, Resistenz enresultiert oft als Folge von gezielten Therapien und die Krankheit fortschreitet zu einem fortgeschrittenen metastasierenden CRPC². CRPC wird von der zweiten Generation der AR-Therapie behandelt, die Enzalutamid und Abirateron²umfasst,^3, die das Überleben zunächst verbessert. Allerdings treten tödliche Varianten wie NEPC häufig in 25 bis 30 % der behandelten CRPC-Fälle auf, die nur begrenzte Behandlungsmöglichkeiten haben, was zu einer erhöhten Sterblichkeit^{führt 3}. NEPC entsteht über einen reversiblen Transdifferenzierungsprozess namens NED, bei dem PCa-Zellen einen Abstammungswechsel von Adenokarzinomen durchlaufen und eine verminderte Expression von AR und eine erhöhte Expression von NE-Linienmarkern wie Enolase 2 (ENO2), Chromogranin A (CHGA) und Synaptophysin (SYP)⁴zeigen. Angesichts der Tatsache, dass diese Resistenzvarianten als Ergebnis therapeutischer Interventionen entstehen, ist es wichtig, Wege zu entschlüsseln, die zur Erzeugung dieser tödlichen, schwer zu behandelnden Form von PCa führen.

Die Genomik von NEPC wurde kürzlich in einer umfassenden Studie von Beltran et al. entschlüsselt, in der Kopiernummernänderungen, Mutationen, einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNPs) und DNA-Methylierung aus patientenabgeleiteten metastasierenden Geweben analysiert wurden⁵. Trotz signifikanter Fortschritte im Verständnis der Genomik dieser aggressiven Form von PCa ist wenig über die epigenetischen Faktoren bekannt, einschließlich der kleinen nicht-kodierenden RNAs (microRNAs), die am Übergang von CRPC-Adenokarzinom zu NEPC beteiligt sind. MicroRNAs (miRNAs) sind 22 bp lange, doppelsträngige RNAs, die in erster Linie durch die Unterdrückung der Genexpression posttranskriptionär durch sequenzspezifische Wechselwirkungen mit den 3′-unübersetzten Regionen (UTRs) von cognate mRNA-Targets⁶wirken. Mehrere OncomiRs und Tumorsuppressoren wurden jetzt identifiziert, und ihre Rolle bei der Regulierung von Krankheitsbeginn und Metastasen wurde bei verschiedenen Krebsarten gut untersucht^6,7. Diese kleinen nicht-kodierenden RNAs dienen oft als sehr wichtige Ziele bei der Kontrolle der Krankheitssterblichkeit^6,8,9. Neuere Forschungen konzentrierten sich auf das Verständnis der parakrinen Wirkungen von miRNAs in Krebsmetastas über ihren Transport in EVs, wie Exosomen, die in den Blutkreislauf fließen und es Tumorzellen ermöglichen, diese sekundären Botenstoffe an metastasierende Stellen in einer nukleasefreien Umgebung zu senden^10,11,12. EVs tragen miRNAs aus den Tumorzellen, um die transformierenden Effekte von den Wirtszellen¹²zu übertragen. Die Identifizierung von Elektrofahrzeugen als sekundäre Botenstoffe von Tumorzellen kann daher bei der nichtinvasiven Erkennung des Schweregrads von Krankheiten nützlich sein.

Der miR-1246 ist stark hochreguliert in EVs von aggressiven PCa, und es zeigt die Krankheit Schwere¹³. Diese EV-assoziierten miRNAs dienen nicht nur als nichtinvasive Biomarker der Krankheit, sondern spielen auch eine funktionell wichtige Rolle bei der Förderung der Tumorgenese. Daher ist es wichtig, die Bedeutung des miRNA-Repertoires zu verstehen, das mit resistenten Formen von PCa verbunden ist, um eine bessere Identifizierung nichtinvasiver Biomarker sowie deren funktionelle Bedeutung zu ermöglichen.

Das Aufkommen der Sequenzierung der nächsten Generation bietet die umfassendste Plattform, um die Details der Tumorlandschaft mit Veränderungen im Genom wie Mutationen, chromosomale Verlagerungen, Chromothripse und Methylierung zu untersuchen, die alle wesentlich zur Form und Natur von Krebs beitragen^14,15,16. Ebenso ist es auch ein wesentliches Werkzeug, um die enormen epigenomischen Veränderungen zu verstehen, die in einer Tumorzelle auftreten und die oft wichtige Akteure in der Krankheitsschwere¹⁷sind. Mit dem Ziel, das miRNA-Repertoire zu verstehen, das mit der Generierung von NEPC verbunden ist, wurde eine kleine RNA-Sequenzierung an FFPE-metastasierenden CRPC-Geweben und den entsprechenden Serum-abgeleiteten EVs durchgeführt. RNA, die aus einer dieser beiden Probenquellen gewonnen wird, ist (1) ertragsarm und (2) von schlechter Qualität aufgrund des Abbaus, der häufig durch Formalinfixierung und EV-Isolation auftritt. Darüber hinaus ist das Generieren von cDNA-Bibliotheken ein kritischer, aber umständlicher Schritt eines Sequenzierungslaufs. Daher erfordern Methoden zur Isolierung dieser RNAs und deren Verwendung zum Generieren von Bibliotheken für die kleine RNA-Sequenzierung eine Optimierung, um genaue und zuverlässige Daten zu generieren.

Es gibt mehrere Methoden, um die miRNA-Expression in verschiedenen Proben zu profilieren, einschließlich RT-PCR, Mikroarrays und In-situ-Hybridisierung (ISH). Ein Protokoll, das FFPE-Gewebe-abgeleitete RNA zur Bewertung der miRNA-Expression durch RT-PCR und ISH verwendet, wurde kürzlich veröffentlicht¹⁸. Neuere Technologien bieten umfassendere und umfassendere Plattformen für die Profilierung der miRNA-Expression in einer Stichprobe. NanoString nCounter bietet eine empfindliche miRNA-Erkennungsplattform¹⁹, aber die Erkennung wird oft durch die Anzahl der miRNAs begrenzt, die im Array verfügbar sind (2.000). In einem solchen Szenario bietet eine sensiblere und erschöpfendere Plattform wie die Sequenzierung der nächsten Generation eine viel breitere Tiefe der miRNA-Identifikation und gleichzeitigen Profilerstellung in verschiedenen Proben²⁰. Die Methode wurde verwendet, um die miRNA-Signaturen im Urin oder Plasma von PCa-Patienten^21,22,23zu bestimmen. Im aktuellen Artikel wird ein Protokoll vorgestellt, um eine Sequenzierungsplattform der nächsten Generation zu verwenden, um miRNA-Profile im Zusammenhang mit aggressivem CRPC mit FFPE-Geweben und serumabgeleiteten EV RNAs zu untersuchen.

Protocol

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien der US Common Rule durchgeführt und vom Institutional Committee on Human Research genehmigt. 1. Mikrodissektion HINWEIS: FFPE-metastasiertes CRPC-Gewebe mit Adenokarzinom-Merkmalen (CRPC-Adeno) oder NE-Differenzierung (CRPC-NE) wurden aus dem Prostate Cancer Biorepository Network (PCBN) gewonnen. ZehnMikron PCa Abschnitte auf Glasrutschen wurden für die manuelle Mikrodissektion vor…

Representative Results

Die Bibliothek wurde nach der RNA-Isolierung vorbereitet und eine Qualitätsprüfung durchgeführt. Die Gelreinigung für die verstärkte cDNA-Bibliothek, die aus RNA hergestellt wird, die aus mikrosezierten Geweben und serumabgeleiteten Elektrofahrzeugen isoliert ist, ist in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellt. Die Produktgröße für adaptor-ligted miRNAs entsprach etwa 136-160 bp für jede Probe. Abbildung 1A-B</strong…

Discussion

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zum Isolieren von RNA aus FFPE-Geweben und serumabgeleiteten Elektrofahrzeugen mithilfe von Kits, die optimiert wurden, um die Ausbeute und Qualität isolierter RNAs zu erhöhen. Darüber hinaus wurden die gereinigten RNAs verwendet, um cDNA-Bibliotheken für die kleine RNA-Sequenzierung zu generieren. Beide aufgeführten Schritte sind für die Bestimmung der Qualität und Tiefe der Sequenzierungslesevorgänge, die das Endergebnis der Ausführung²⁴si…

Materials

3M NaOAc pH 5.5	USB Corp.	75897 100 mL
5 µm filter tubes	IST Engineering Inc.	5388-50
6% TBE polyacrylamide gels	Novex	EC6265BOX
BaseSpace	Illumina		Analysis software
Bio-analyzer	Agilent
DNA loading dye	Novex	LC6678
Eppendorf Thermostat plus	Eppendorf 1.5 mL
EtBr	Pierce	17898
Ethyl alcohol 200 proof	Pharmco	111000200
Exosomal RNA isolation kit	Norgen	58000
Gel breaking tubes	IST Engineering Inc.	3388-100
Glycogen molecular biology grade	Thermo Scientifc	R0561
Hematoxylin Select	Stat lab	SL401
Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676	accuSpin Micro 17R
miRNeasy FFPE kit	Qiagen	217504
Nanodrop	Thermo Scientifc	Nano Drop 1000
Nanosight NTA	Malvern	LM14
NextSeq 500 Sequencer	Illumina
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)	Illumina	FC-404-2001
Pellet paint	Millipore	70748-3
Superscript II Reverse Transcriptase	Invitogen	18064014
T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant	Lucigen	LR2D11310K
TBE Running buffer (5X)	Novex	LC6675
Thermal cycler	MJ Research	PTC100
Total exosome isolation reagent (from serum)	Invitrogen	4478360
TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)	Illumina	RS-200-0012
Xylene	Fisher Scientific	X3P- 1GAL
RNA 3' Primer			GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
RNA 5' Primer			TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
Stop Oligo			GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG
RNA RT Primer			GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
RNA PCR Primer			AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
RNA PCR Index Primer			CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
–	–	–	6 bases in adapter
RNA PCR Index Primer 1			CGTGAT
RNA PCR Index Primer 2			ACATCG
RNA PCR Index Primer 3			GCCTAA
RNA PCR Index Primer 4			TGGTCA
RNA PCR Index Primer 5			CACTGT
RNA PCR Index Primer 6			ATTGGC
RNA PCR Index Primer 7			GATCTG
RNA PCR Index Primer 8			TCAAGT
RNA PCR Index Primer 9			CTGATC
RNA PCR Index Primer 10			AAGCTA
RNA PCR Index Primer 11			GTAGCC
RNA PCR Index Primer 12			TACAAG