Secuenciación de ARN pequeño no codificante de tejidos fijos de formalina y exosomas derivados del suero de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración
Summary
La resistencia a la terapia a menudo se desarrolla en pacientes con cáncer de próstata avanzado, y en algunos casos, el cáncer progresa a un subtipo letal llamado cáncer de próstata neuroendocrino. Evaluar los pequeños cambios moleculares no codificantes mediados por ARN que facilitan esta transición permitiría una mejor estratificación de enfermedades e identificación de mecanismos causales que conducen al desarrollo de cáncer de próstata neuroendocrino.
Abstract
La ablación del receptor de andrógenos (AR) señalización por privación de andrógenos es el objetivo de la primera línea de terapia para el cáncer de próstata que inicialmente resulta en la regresión del cáncer. Sin embargo, en un número significativo de casos, la enfermedad progresa a cáncer de próstata avanzado y resistente a la castración (CRPC), que tiene opciones terapéuticas limitadas y a menudo es agresivo. La metástasis distante se observa principalmente en esta etapa de la enfermedad agresiva. La CRPC es tratada por una segunda generación de inhibidores de la vía AR que mejoran la supervivencia inicialmente, seguido de la aparición de resistencia terapéutica. El cáncer de próstata neuroendocrino (NEPC) es una rara variante del cáncer de próstata (PCa) que a menudo se desarrolla como resultado de la resistencia terapéutica a través de un proceso de transdiferenciación conocido como diferenciación neuroendocrino (NED), en el que las células PCa se someten a un interruptor de linaje adenocarcinomas y muestran una mayor expresión de marcadores de linaje neuroendocrino (NE). Además de las alteraciones genómicas que impulsan la progresión y transdiferenciación a la NEPC, los factores epigenéticos y las señales microambientales se consideran actores esenciales para impulsar la progresión de la enfermedad. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para identificar los controladores epigenéticos (es decir, pequeños ARN no codificantes) que están asociados con PCa avanzado. Utilizando microRNAs purificados a partir de tejidos metastásicos incorporados en parafina fijada de formalina (FFPE) y las correspondientes vesículas extracelulares derivadas del suero (EV), el protocolo describe cómo preparar bibliotecas con el control de calidad adecuado para la secuenciación microRNAs de estas fuentes de muestra. Aislar el ARN de FFPE y EVs es a menudo difícil porque la mayor parte de él está degradado o es limitado en cantidad. Este protocolo elaborará diferentes métodos para optimizar las entradas de ARN y las bibliotecas de ADNr para producir la mayoría de las lecturas específicas y los datos de alta calidad tras la secuenciación.
Introduction
El cáncer de próstata es impulsado por andrógenos que actúan a través de la señalización AR. Por lo tanto, apuntar a la vía de AR es el tratamiento principal para la enfermedad1. Sin embargo, la resistencia a menudo se produce como resultado de terapias dirigidas y la enfermedad progresa a un CRPC2metastásico avanzado. CRPC es tratado por la segunda generación de arretroterapia que incluye enzalutamida y abiraterona2,3 que mejora la supervivencia inicialmente. Sin embargo, las variantes letales como la NEPC a menudo emergen en el 25-30% de los casos de CRPC tratados que tienen opciones de tratamiento limitadas, lo que conduce a un aumento de la mortalidad3. EL NEPC surge a través de un proceso de transdiferenciación reversible conocido como NED, en el que las células DeC se someten a un cambio de linaje de adenocarcinomas y muestran una disminución de la expresión de AR y una mayor expresión de marcadores de linaje NE incluyendo enolase 2 (ENO2), cromogranina A (CHGA) y sinaptofisina (SYP)4. Dado que estas variantes de resistencia surgen como resultado de intervenciones terapéuticas, es esencial descifrar vías que conducen a la generación de esta forma mortal, difícil de tratar de PCa.
La genómica de NEPC fue descifrada recientemente en un exhaustivo estudio realizado por Beltrán y otros en el que se analizaron alteraciones del número de copias, mutaciones, polimorfismos de nucleótido único (SNP) y metilación del ADN de tejidos metastásicos derivados del paciente5. A pesar de los avances significativos en la comprensión de la genómica de esta forma agresiva de PCa, poco se sabe sobre los factores epigenéticos, incluyendo los pequeños ARN no codificantes (microARN) que están involucrados en la transición del CRPC-adenocarcinoma a NEPC. Los MicroRNAs (miRNAs) son ARN de 22 bp de largo y doble cadena que actúan principalmente suprimiendo la expresión génica post-transcripción mediante interacciones específicas de secuencia con las 3 regiones no traducidas (UTR) de las metas de ARNm cognado6. Ahora se han identificado varios oncomiRs y supresores de tumores, y su papel en la regulación de la aparición de la enfermedad y la metástasis ha sido bien estudiado en diferentes cánceres6,7. Estos pequeños ARN no codificantes a menudo sirven como objetivos muy importantes en el control de la mortalidad por enfermedad6,8,9. Investigaciones más recientes se han centrado en la comprensión de los efectos paracrinos de los miRNAs en la metástasis oncológica a través de su transporte en vehículos eléctricos, como los exosomas, que fluyen en el torrente sanguíneo y permiten que las células tumorales envíen a estos mensajeros secundarios a lugares metastásicos en un ambiente libre de nucleasas10,11,12. Los vehículos eléctricos transportan miRNAs de las células tumorales para transferir los efectos transformadores de las células huésped12. Por lo tanto, la identificación de los vehículos eléctricos como mensajeros secundarios de las células tumorales puede ser útil en la detección no invasiva de la gravedad de la enfermedad.
El miR-1246 está altamente regulado en vehículos eléctricos de PCa agresivo, e indica la gravedad de la enfermedad13. Estos miRNAs asociados a EV no sólo sirven como biomarcadores no invasivos de la enfermedad, sino que también desempeñan funciones funcionalmente importantes en la conducción de la tumorigenesis. Por lo tanto, es esencial entender la importancia del repertorio miRNA que se asocia con formas resistentes de PCa para permitir una mejor identificación de los biomarcadores no invasivos, así como su significado funcional.
El advenimiento de la secuenciación de próxima generación ha ofrecido la plataforma más completa para estudiar los detalles del paisaje tumoral que implican alteraciones en el genoma como mutaciones, reubicaciones cromosómicas, cromoripsis y metilación, todas las cuales contribuyen significativamente a la forma y naturaleza del cáncer14,15,16. Del mismo modo, también es una herramienta esencial para entender los vastos cambios epigenómicos que se producen en una célula tumoral y que a menudo son actores importantes en la gravedad de la enfermedad17. Con el objetivo de entender el repertorio de miRNA asociado con la generación de NEPC, se realizó la secuenciación de ARN pequeño en los tejidos CRPC metastásicos FFPE y sus correspondientes vehículos eléctricos derivados del suero. El ARN derivado de cualquiera de estas dos fuentes de muestra es (1) bajo en rendimiento y (2) de mala calidad debido a la degradación que a menudo ocurre debido a la fijación de formalina y aislamiento EV. Además, la generación de bibliotecas de ADNc es un paso crítico, pero engorroso, de una ejecución de secuenciación. Por lo tanto, los métodos para aislar estos ARN y usarlos para generar bibliotecas para la secuenciación de ARN pequeño requieren optimización para generar datos precisos y confiables.
Existen varios métodos para perfilar la expresión de miRNA en diferentes muestras, incluyendo RT-PCR, microarrays e hibridación in situ (ISH). Recientemente se publicó un protocolo que utiliza ARN derivado del tejido FFPE para evaluar la expresión de miRNA por RT-PCR e ISH18. Las tecnologías más recientes ofrecen plataformas más exhaustivas y completas para la generación de perfiles de expresión de miRNA en una muestra. NanoString nCounter ofrece una plataforma de detección de miRNA sensible19, pero la detección a menudo está limitada por el número de miRNAs que están disponibles en la matriz (2.000 euros). En tal escenario, una plataforma más sensible y exhaustiva como la secuenciación de próxima generación ofrece una profundidad mucho más amplia de identificación de miRNA y perfilado simultáneo en diferentes muestras20. El método se ha utilizado para determinar las firmas de miRNA en orina o plasma de los pacientes con PCa21,22,23. En el artículo actual, se presenta un protocolo para utilizar una plataforma de secuenciación de próxima generación para estudiar perfiles de miRNA asociados con CRPC agresivo utilizando tejidos FFPE y ARN EV derivados del suero.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, describimos un protocolo para aislar el ARN de los tejidos FFPE y los vehículos eléctricos derivados del suero utilizando kits optimizados para aumentar el rendimiento y la calidad de los ARN aislados. Además, los ARN purificados se utilizaron para generar bibliotecas de ADNc para la secuenciación de ARN pequeño. Ambos pasos enumerados son esenciales para determinar la calidad y profundidad de las lecturas de secuenciación que son el resultado final de la ejecución24. Por…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por la Actividad de Adquisición de Investigación Médica del Ejército de los Estados Unidos (USAMRAA) a través del Premio de Desarrollo de Ideas bajo el Premio No. W81XWH-18-1-303 y W81XWH-18-2-0013 y adicionalmente por Premio no. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018 y W81XWH-18-2-0019 Prostate Cancer Biorepository Network (PCBN). También se reconoce el apoyo a los autores del laboratorio de autores por parte del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud (Número de Subvención RO1CA177984). Rajvir Dahiya es Científico Senior de Investigación en el Departamento de Asuntos de Veteranos, BX004473 y financiado por NIH-UO1CA199694 (RD). Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las del autor y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de Defensa o el Ejército de los Estados Unidos. Estamos agradecidos a Judy Shigenaga, directora de instalaciones básicas de San Francisco VAMC, por su ayuda con el secuenciador NextSeq 500.
Materials
| 3M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5X) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| – | – | – | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
Referencias
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