Sequenziamento di piccoli RNA non codificanti da tessuti fissati in formalina ed esosomi derivati dal siero da pazienti affetti da cancro alla prostata resistenti alla castrazione

Summary

La resistenza alla terapia si sviluppa spesso in pazienti con carcinoma della prostata avanzato e, in alcuni casi, il cancro progredisce verso un sottotipo letale chiamato cancro alla prostata neuroendocrino. Valutare i piccoli cambiamenti molecolari mediati dall’RNA non codificanti che facilitano questa transizione consentirebbe una migliore stratificazione della malattia e l’identificazione di meccanismi causali che portano allo sviluppo del cancro alla prostata neuroendocrino.

Abstract

L’ablazione del recettore degli androgeni (AR) mediante privazione di androgeni è l’obiettivo della prima linea di terapia per il cancro alla prostata che inizialmente si traduce nella regressione del cancro. Tuttavia, in un numero significativo di casi, la malattia progredisce verso il cancro alla prostata avanzato e resistente alla castrazione (CRPC), che ha opzioni terapeutiche limitate ed è spesso aggressivo. La metastasi distante è osservata per lo più in questa fase della malattia aggressiva. CRPC è trattato da una seconda generazione di inibitori della via AR che migliorano la sopravvivenza inizialmente, seguita dall’emergere della resistenza alla terapia. Il cancro alla prostata neuroendocrina (NEPC) è una rara variante del cancro alla prostata (PCa) che spesso si sviluppa a seguito della resistenza terapeutica attraverso un processo di transdifferenziazione noto come differenziazione neuroendocrina (NED), in cui le cellule PCa subiscono un interruttore di lignaggio da adenocarcinomi e mostrano una maggiore espressione dei marcatori di lignaggio neuroendocrina (NE). Oltre alle alterazioni genomiche che guidano la progressione e la transdifferenziazione al NEPC, i fattori epigenetici e i segnali microambientali sono considerati attori essenziali nel guidare la progressione della malattia. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per identificare i driver epigenetici (cioè piccoli RNA non codificanti) associati alla PCa avanzata. Utilizzando microRNA purificati provenienti da tessuti metastatici incorporati in paraffina fissata in formalina (FFPE) e vescicle extracellulari (EV) derivate dal siero, il protocollo descrive come preparare le librerie con un adeguato controllo di qualità per il sequenziamento microRNA da queste fonti campione. Isolare l’RNA sia da FFPE che da EV è spesso difficile perché la maggior parte di esso è degradato o è limitato in quantità. Questo protocollo elaborerà diversi metodi per ottimizzare gli input di RNA e le librerie cDNA per produrre la maggior parte delle letture specifiche e dei dati di alta qualità al momento del sequenziamento.

Introduction

Il cancro alla prostata è guidato da androgeni che agiscono tramite segnalazione AR. Pertanto, il targeting del percorso AR è il trattamento di soggiorno principale per la malattia¹. Tuttavia, la resistenza spesso deriva come risultato di terapie mirate e la malattia progredisce a un Avanzato Metastatico CRPC². CRPC è trattato da seconda generazione di terapia AR che include enzalutamide e abiraterone^2,3 che migliora la sopravvivenza inizialmente. Tuttavia, varianti letali come NEPC spesso emergono nel 25-30% dei casi di CRPC trattati che hanno opzioni di trattamento limitate, portando ad un aumento della mortalità³. NEPC nasce attraverso un processo di transdifferenziazione reversibile noto come NED, in cui le cellule PCa subiscono un interruttore di lignaggio da adenocarcinomi e mostrano una diminuzione dell’espressione di AR e una maggiore espressione di marcatori di lignaggio NE tra cui enolasi 2 (ENO2), cromogranina A (CHGA) e sinaptophysina (SYP)⁴. Dato che queste varianti di resistenza sorgono come risultato di interventi terapeutici, è essenziale decifrare percorsi che portano alla generazione di questa forma mortale e difficile da trattare di PCa.

La genomica di NEPC è stata recentemente decifrata in uno studio esaustivo condotto da Beltran e t al. per cui sono state analizzate alterazioni del numero di copie, mutazioni, polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) e metilazione del DNA da tessuti metastatici derivati dal paziente^{5 .} Nonostante un significativo progresso nella comprensione della genomica di questa forma aggressiva di PCa, si sa poco sui fattori epigenetici, compresi i piccoli RNA non codificanti (microRNA) che sono coinvolti nella transizione di CRPC-adenocarcinoma a NEPC. I microRNA (miRNA) sono rna lunghi 22 bp e a doppio filamento che agiscono principalmente sopprimendo l’espressione genica post-transcriing mediante interazioni specifiche della sequenza con le regioni 3′-untranslated (UTR) di bersagli mRNA cognati⁶. Sono stati ora identificati diversi oncomiR e soppressori tumorali, e il loro ruolo nella regolazione dell’insorgenza e della metastasi della malattia è stato ben studiato in diversi tipi di cancro^6,7. Questi piccoli RNA non codificanti spesso servono come obiettivi molto importanti nel controllo della mortalità per malattia^6,8,9. Ricerche più recenti si sono concentrate sulla comprensione degli effetti paracrini dei miRNA nella metastasi tumorale attraverso il loro trasporto in veicoli elettrici, come gli esosomi, che fluiscono nel flusso sanguigno e consentono alle cellule tumorali di inviare questi messaggeri secondari in luoghi metastatici in un ambiente privo di nuclesi^10,11,12. Gli EV trasportano miRNA dalle cellule tumorali per trasferire gli effetti di trasformazione dalle cellule ospiti¹². L’identificazione dei veicoli elettrici come messaggeri secondari delle cellule tumorali può quindi essere utile per il rilevamento non invasivo della gravità della malattia.

Il miR-1246 è altamente regolato nei veicoli elettrici da PCa aggressiva, e indica la gravità della malattia¹³. Questi miRNA associati agli EV non solo servono come biomarcatori non invasivi della malattia, ma svolgono anche un ruolo funzionalmente importante nel guidare la tumorigenesi. Pertanto, è essenziale comprendere il significato del repertorio miRNA associato a forme resistenti di PCa per consentire una migliore identificazione dei biomarcatori non invasivi e il loro significato funzionale.

L’avvento del sequenziamento di nuova generazione ha offerto la piattaforma più completa per studiare i dettagli del paesaggio tumorale che coinvolgono alterazioni del genoma come mutazioni, trasferimenti cromosomici, cromotrasi e metilazione, che contribuiscono in modo significativo alla forma e alla natura del cancro^14,15,16. Allo stesso modo, è anche uno strumento essenziale per comprendere i vasti cambiamenti epigenomici che si verificano in una cellula tumorale e che sono spesso attori importanti nella gravità della malattia¹⁷. Con l’obiettivo di comprendere il repertorio miRNA associato alla generazione di NEPC, è stato eseguito un piccolo sequenziamento dell’RNA sui tessuti CRPC metastatici FFPE e sui corrispondenti EV derivati dal siero. L’RNA derivato da una di queste due fonti di campioni è (1) basso rendimento e (2) di cattiva qualità a causa della degradazione che spesso si verifica a causa della fissazione formalina e dell’isolamento degli EV. Inoltre, la generazione di librerie cDNA è un passaggio critico, ma ingombrante, di un’esecuzione di sequenziamento. Pertanto, i metodi per isolare questi RNA e utilizzarli per generare librerie per piccoli sequenzidi di RNA richiedono l’ottimizzazione per generare dati accurati e affidabili.

Ci sono diversi metodi per profilare l’espressione del miRNA in diversi campioni, tra cui RT-PCR, microarray e ibridazione in situ (ISH). Un protocollo che utilizza l’RNA derivato dal tessuto FFPE per valutare l’espressione di miRNA da RT-PCR e ISH è stato recentemente pubblicato¹⁸. Tecnologie più recenti offrono piattaforme più esaustive e complete per la profilazione dell’espressione miRNA in un campione. NanoString nCounter offre una piattaforma sensibile di rilevamento miRNA¹⁹, ma il rilevamento è spesso limitato dal numero di miRNA disponibili nell’array (2.000 dollari). In uno scenario di questo tipo, una piattaforma più sensibile ed esaustiva come il sequenziamento di nuova generazione offre una profondità molto più ampia di identificazione del miRNA e la profilazione simultanea in diversi campioni²⁰. Il metodo è stato utilizzato per determinare le firme di miRNA nelle urine o nel plasma da pazienti PCa^21,22,23. Nell’articolo attuale, viene presentato un protocollo per utilizzare una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione per studiare i profili di miRNA associati a CRPC aggressivi utilizzando tessuti FFPE e RNA EV derivati dal siero.

Protocol

Questo studio è stato condotto in conformità con le linee guida etiche della Regola Comune degli Stati Uniti ed è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Ricerca Umana. 1. Microdissezione NOT:</ Tessuti CRPC metastatici FFPE con caratteristiche adenocarcinoma (CRPC-Adeno) o differenziazione NE (CRPC-NE) sono stati ottenuti dal Prostate Cancer Biorepository Network (PCBN). Sono state preparate dieci sezioni PCa su vetrini di vetro per la micr…

Representative Results

La libreria è stata preparata dopo l’isolamento dell’RNA ed è stato eseguito un controllo di qualità. La purificazione del gel per la libreria amplificata di cDNA preparata da RNA isolata da tessuti microdisseci e EV derivati dal siero è illustrata nella Figura 1 e nella Figura 2. La dimensione del prodotto per i miRNA adadattatore corrispondeva a circa 136-160 bp per ogni campione. Figura 1A-B sono contrassegna…

Discussion

In questo articolo, descriviamo un protocollo per isolare l’RNA dai tessuti FFPE e dagli EV derivati dal siero utilizzando kit ottimizzati per aumentare la resa e la qualità degli RNA isolati. Inoltre, gli RNA purificati sono stati utilizzati per generare librerie di cDNA per piccoli sequenziadi di RNA. Entrambi i passaggi elencati sono essenziali per determinare la qualità e la profondità delle letture di sequenziamento che sono il risultato finale della corsa²⁴. Pertanto, l’ottimizzazione di …

Materials

3M NaOAc pH 5.5	USB Corp.	75897 100 mL
5 µm filter tubes	IST Engineering Inc.	5388-50
6% TBE polyacrylamide gels	Novex	EC6265BOX
BaseSpace	Illumina		Analysis software
Bio-analyzer	Agilent
DNA loading dye	Novex	LC6678
Eppendorf Thermostat plus	Eppendorf 1.5 mL
EtBr	Pierce	17898
Ethyl alcohol 200 proof	Pharmco	111000200
Exosomal RNA isolation kit	Norgen	58000
Gel breaking tubes	IST Engineering Inc.	3388-100
Glycogen molecular biology grade	Thermo Scientifc	R0561
Hematoxylin Select	Stat lab	SL401
Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676	accuSpin Micro 17R
miRNeasy FFPE kit	Qiagen	217504
Nanodrop	Thermo Scientifc	Nano Drop 1000
Nanosight NTA	Malvern	LM14
NextSeq 500 Sequencer	Illumina
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)	Illumina	FC-404-2001
Pellet paint	Millipore	70748-3
Superscript II Reverse Transcriptase	Invitogen	18064014
T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant	Lucigen	LR2D11310K
TBE Running buffer (5X)	Novex	LC6675
Thermal cycler	MJ Research	PTC100
Total exosome isolation reagent (from serum)	Invitrogen	4478360
TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)	Illumina	RS-200-0012
Xylene	Fisher Scientific	X3P- 1GAL
RNA 3' Primer			GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
RNA 5' Primer			TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
Stop Oligo			GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG
RNA RT Primer			GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
RNA PCR Primer			AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
RNA PCR Index Primer			CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
–	–	–	6 bases in adapter
RNA PCR Index Primer 1			CGTGAT
RNA PCR Index Primer 2			ACATCG
RNA PCR Index Primer 3			GCCTAA
RNA PCR Index Primer 4			TGGTCA
RNA PCR Index Primer 5			CACTGT
RNA PCR Index Primer 6			ATTGGC
RNA PCR Index Primer 7			GATCTG
RNA PCR Index Primer 8			TCAAGT
RNA PCR Index Primer 9			CTGATC
RNA PCR Index Primer 10			AAGCTA
RNA PCR Index Primer 11			GTAGCC
RNA PCR Index Primer 12			TACAAG