רצפי RNA קטן ללא קידוד מתוך פורמאלין-רקמות קבועות וסרום-אקסוזומים נגזרות מחולי סרטן הערמונית עמידים סירוס
Summary
התנגדות תרפיה מתפתחת לעתים קרובות בחולים עם סרטן הערמונית מתקדם, ובמקרים מסוימים, סרטן מתקדם לסוג קטלני שנקרא סרטן הערמונית נוירואנדוקריניים. הערכת קטן ללא קידוד RNA-תיווך שינויים מולקולריים המאפשרים מעבר זה יאפשר מחלות טוב יותר ריבוד וזיהוי של מנגנונים סיבתי המובילים לפיתוח של סרטן הערמונית נוירואנדוקריניים.
Abstract
אבלציה של קולטן האנדרוגן (AR) איתות על ידי מניעת אנדרוגן היא המטרה של הקו הראשון של טיפול בסרטן הערמונית שגורמת בתחילה רגרסיה הסרטן. עם זאת, במספר משמעותי של מקרים, המחלה מתקדמת מתקדם, סירוס עמידים בסרטן הערמונית (CRPC), אשר יש אפשרויות טיפוליות מוגבלות הוא לעתים קרובות אגרסיבי. גרורות רחוקות נצפה בעיקר בשלב זה של המחלה האגרסיבית. CRPC מטופלת על ידי דור שני של מעכבי מסלול AR כי לשפר את ההישרדות בתחילה, ואחריו הופעתה של התנגדות תרפיה. סרטן הערמונית נוירואנדוקריניים (NEPC) הוא גרסה נדירה של סרטן הערמונית (PCa) כי לעתים קרובות מתפתחת כתוצאה של התנגדות תרפיה דרך תהליך בידול המכונה בידול נוירואנדוקרינים (נד), שבו תאים PCa לעבור מעבר השושלת מ אדנוקרצינומות ולהראות ביטוי מוגבר של סמני השושלת הנוירואנדוקריניים (NE). בנוסף על שינויים גנומית המניע את ההתקדמות ואת השינויים כדי NEPC, גורמים אפיגנטיים ורמזים microenvironmental נחשבים שחקנים חיוניים התקדמות המחלה הנהיגה. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורט כדי לזהות את הנהגים epigenetic (כלומר, RNAs קטנים שאינם קידוד) המשויכים PCa מתקדם. באמצעות מיקרורונאס מטוהרים מתוך formalin-קבוע פרפין-מוטבע (FFPE) רקמות גרורתי מתאים הסרום הנגזר הנגזרות ושלפוחיות (EVs), הפרוטוקול מתאר כיצד להכין ספריות עם בקרת איכות המתאימה לרצף מיקרורונאס ממקורות אלה לדוגמה. בידוד רנ א משניהם FFPE ו EVs הוא לעתים קרובות מאתגרת, כי רוב זה מושפל או מוגבל בכמות. פרוטוקול זה יהיה להרחיב על שיטות שונות כדי לייעל את כניסות RNA וספריות cDNA כדי להניב קריאות ספציפיות ביותר ונתונים באיכות גבוהה על רצף.
Introduction
סרטן הערמונית מונע על ידי אנדרוגנים משחק דרך איתות AR. לכן, מיקוד מסלול AR הוא הטיפול הבעד של המחלה1. עם זאת, התנגדות לעתים קרובות מנסחלת כתוצאה של טיפולים ייעודיים והמחלה מתקדמת ל-CRPC גרורתית מתקדם2. Crpc הוא טיפל בדור השני של טיפול AR הכולל enzalutamide ו abiraterone2,3 אשר משפר את ההישרדות בתחילה. עם זאת, משתנים קטלניים כגון NEPC לעתים קרובות להגיח 25 ל 30% של מקרים CRPC מטופלים שיש להם אפשרויות טיפול מוגבלות, המוביל לתמותה מוגברת3. Nepc נוצר באמצעות תהליך בידול הפיך המכונה נד, שבו pca תאים לעבור מעבר השושלת אדנוקרצינומות ולהראות ירידה ביטוי של AR וביטוי מוגבר של סמני השושלת NE כולל אנולאז 2 (ENO2), כרומוגראנס a (chga), ו synaptophysin (syp)4. בהינתן כי אלה משתנים התנגדות להיווצר כתוצאה של התערבויות טיפוליות, זה חיוני לפענח מסלולים המובילים לדור של זה קטלני, קשה לטפל בצורה של PCa.
הגנומיקה של NEPC פוענח לאחרונה במחקר ממצה שנעשה על ידי באלטרן אל. לפיו העתקת מספר שינויים, מוטציות, נוקלאוטיד יחיד מערכת פולימורית (SNPs), ו-DNA מתילציה מ החולה-נגזר רקמות גרורתי נותחו5. למרות התקדמות משמעותית בהבנת הגנומיקה של צורה זו אגרסיבי של PCa, מעט ידוע על הגורמים האפיגנטיים, כולל RNAs קטן לא קידוד (microRNAs) כי הם מעורבים במעבר של CRPC-אדנוקרצינומה כדי NEPC. Micrornas (mirnas) הם 22 bp ארוך, כפול תקועים rnas כי לפעול בעיקר על ידי דיכוי ביטוי הגנים לאחר ההמרה על ידי אינטראקציות ספציפיות רצף עם 3 ‘-אזורים בלתי מתורגמים (utrs) של מטרות mrna הקנצוני6. כמה oncomirs ו דכאי הגידול כבר זוהו, ואת תפקידם בוויסות התפרצות המחלה גרורות כבר נחקרו היטב בסוגי סרטן שונים6,7. אלה שאינם קידוד קטן rnas לעתים קרובות משמשים מטרות חשובות מאוד בשליטה תמותת מחלות6,8,9. מחקרים שנעשו לאחרונה התמקדו הבנת ההשפעות הפרפרין של miRNAs בסרטן גרורות דרך התחבורה שלהם ב EVs, כגון אקסוזומים, כי זרימה במחזור הדם ולאפשר לתאי הגידול לשלוח אלה שליחים משניים למיקומים גרורתית בסביבה חופשית nuclease10,11,12. EVs לסחוב miRNAs מתאי הגידול כדי להעביר את ההשפעות שינוי צורה של תאים מארחים12. זיהוי של EVs כמו שליחים משניים של תאים סרטניים יכול אפוא להיות שימושי זיהוי לא פולשני של חומרת המחלה.
מיר-1246 הוא מאוד upregulated ב EVs מ אגרסיבי PCa, וזה מצביע על חומרת המחלה13. אלה miRNAs הקשורים EV לא רק לשמש בסמנים בלתי פולשנית של המחלה, אלא גם לשחק תפקידים חשובים פונקציונלית בנהיגה tuמוריגנזה. כך, חיוני להבין את המשמעות של רפרטואר miRNA כי הוא קשור לצורות עמידות של PCa כדי לאפשר זיהוי טוב יותר של סמנים שאינם פולשנית, כמו גם משמעותם הפונקציונלית.
הופעתו של רצף הדור הבא הציע את הפלטפורמה המקיפה ביותר כדי ללמוד את הפרטים של נוף הגידול מעורבים שינויים הגנום כגון מוטציות, מיקומים מחדש כרומוזום, כרומופרזיס, ו מתילציה, כולם תורמים באופן משמעותי לצורה ולטבע של סרטן14,15,16. כמו כן, הוא גם כלי חיוני כדי להבין את שינויים אפיגנומית המכריע המתרחשים בתא הגידול, כי הם לעתים קרובות שחקנים חשובים בחומרת המחלה17. במטרה להבין את הרפרטואר miRNA הקשורים הדור של NEPC, רצפי RNA קטן בוצע על רקמות הקרמד גרורות FFPE ואת הסרום המקביל שלהם נגזר EVs. RNA נגזר מכל אחד מאותם שני מקורות לדוגמה הוא (1) נמוך בתשואה ו (2) של איכות רעה בשל השפלה כי לעתים קרובות קורה בשל קיבעון פורמלין ו-EV בידוד. יתר על כן, יצירת ספריות cDNA היא קריטית, אבל מסורבלת, צעד של רצף הפעלה. כך, שיטות לבידוד RNAs אלה ושימוש בהם כדי ליצור ספריות עבור רצפי RNA קטנים דורשים אופטימיזציה כדי להפיק נתונים מדויקים ואמינים.
קיימות מספר שיטות לפרופיל ביטוי miRNA בדגימות שונות, כולל RT-PCR, מיקרו-מערכים והיברידיזציה באתרו (ISH). פרוטוקול המשתמש ב-RNA הנגזר מרקמות FFPE כדי להעריך את ביטוי miRNA על ידי RT-PCR ו-ISH פורסם לאחרונה18. טכנולוגיות עדכניות יותר מציעות פלטפורמות ממצה ומקיפות יותר ליצירת פרופיל ביטוי miRNA במדגם. ננו מחרוזת nCounter מציע פלטפורמת זיהוי miRNA רגיש19, אבל הזיהוי מוגבל לעתים קרובות על ידי מספר mirna הזמינים במערך (~ 2,000). בתרחיש כזה, פלטפורמה רגישה יותר וממצה כגון רצף הדור הבא מציעה עומק רחב בהרבה של זיהוי מירנא ויצירת פרופיל סימולטני בדגימות שונות20. השיטה שימש כדי לקבוע את החתימות mirna ב שתן או פלזמה מ-pca חולים21,22,23. במאמר הנוכחי, פרוטוקול מוצג להשתמש פלטפורמת רצף הדור הבא כדי לחקור פרופילי miRNA הקשורים CRPC אגרסיבי באמצעות רקמות FFPE ו-EV RNAs נגזר סרום.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לבודד RNA מ-FFPE רקמות ו-סרום נגזר EVs באמצעות ערכות שהיו ממוטבת כדי להגדיל את התשואה והאיכות של RNAs מבודדים. עוד, RNAs מטוהרים שימשו כדי ליצור ספריות cDNA עבור רצפי RNA קטן. שני השלבים המפורטים הם הכרחיים בקביעת האיכות והעומק של קריאות הרצף הבאות הן התוצאה הסופית מהפעלת<sup…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על-ידי הפעילות הרפואית של הצבא האמריקאי לחקר המחקר (USAMRAA) באמצעות פרס התפתחות הרעיון של הפרס לא. W81XWH-18-1-303 ו W81XWH-18-2-0013 ובנוסף על ידי הפרס לא. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH 18-2-0018, ו W81XWH-18-2-0019 סרטן הערמונית ביווריפוטורי רשת (PCBN). מימון תמיכה המחברים ‘ מעבדה על ידי המכון הלאומי לסרטן במוסדות הלאומי לבריאות (גרנט מספר RO1CA177984) מוכרת גם. רג’ביר דהיי הוא מדען בכיר בקריירה מחקר במחלקה לענייני ותיקי, BX004473 וממומן על ידי NIH-UO1CA199694 (RD). דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן אלה של המחבר והן לא בהכרח אושרו על ידי משרד הביטחון או צבא ארה ב. אנו מודים לג Shigenaga, מנהל מתקן הליבה בסן פרנסיסקו VAMC, עבור עזרתה עם NextSeq 500 ברצף.
Materials
| 3M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5X) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| – | – | – | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
Referencias
- Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
- Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
- Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
- Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
- Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Investigación sobre el cáncer. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Investigación sobre el cáncer. 78 (7), 1833-1844 (2018).
- Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
- Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
- Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
- Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
- Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
- Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
- Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
- Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
- Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).
