使用纳米-牛顿分辨率力转换器从骨骼肌肉活检中隔离肌异物并确定收缩函数
Summary
此处介绍的是一个协议，用于评估具有纳米-牛顿分辨率的条纹肌肉肌异半孔的收缩特性。该协议采用基于干涉测量的光学力探头的设置。此设置生成具有高信噪比的数据，并可评估 myofibril 的收缩动力学。
Abstract
条纹肌肉细胞对于人类和动物的活动是必不可少的。单肌肉纤维由肌纤维组成，由连续相连的沙康鱼组成，这是肌肉中最小的收缩单位。沙康功能障碍导致沙康蛋白编码基因突变的患者肌肉无力。对肌磷酸酯力学的研究允许在测量单肌肉纤维的收缩性时，评估行为素-肌素相互作用，而不会产生受损、相邻的肌纤维的潜在混淆效应。肌黄体的极端结构损伤和错位可能导致收缩受损。如果肌黄热动物存在结构损伤，则在隔离过程中或实验期间，它们可能会断裂。此外，在肌磷动物的研究提供了在沙康的几何约束存在的情况下对行为-肌素相互作用的评估。例如，肌纤维的测量可以阐明肌纤维功能障碍是否是沙康蛋白突变的主要影响。此外，由于肌黄磷的直径小，钙溶液或化合物的灌注几乎是瞬间的。这使得肌黄种人非常适合测量力生产期间的激活和放松率。本文所述的协议采用基于法布里-佩罗特干涉仪原理的光学力探头，该干涉仪能够测量纳米牛顿范围内的力，并结合压电长度电机和快速步进灌注系统。此设置使肌黄种力力学能够研究高分辨率力测量。
Introduction
条纹肌肉细胞是日常生活活动不可缺少的。肢体运动、呼吸功能和心脏的泵送运动依赖于肌肉细胞产生的力。骨骼肌由包含一束单肌肉纤维的肌肉分册组成（图1A）。这些肌肉纤维由肌纤维组成，由连续连接的沙球组成（图1B，D）。沙康鱼含有薄而厚的细丝。这些主要由活性素和米奥辛分子链组成（图1B）。行为-肌素相互作用负责肌肉的产生力的能力。编码为沙康蛋白的基因突变的患者，如内布林、奥平和肌蛋白T，由于收缩功能障碍1而出现肌肉无力。
肌肉收缩的质量可以在组织的各个层面研究，从体内整个肌肉到体外运动性测定中的行为-肌素相互作用。在过去的几十年里，几个研究小组已经开发出一些装置，以确定个体肌黄种人,2，3，4，5，6，7，8，9，103,7,8,9,的合同性。4,5,62这些设置基于检测由肌黄种枪收缩引起的悬臂（即光束偏转）的激光偏转变化（详情见 Labuda 等人11）。虽然确定肌黄体联的收缩函数有一些局限性（例如，在肌黄种体上游的激励-收缩耦合过程的动态是缺乏的），但这种方法具有多种优点。其中包括：1） 在沙康人几何约束的情况下评估行为-明辛相互作用的能力;2） 评估行为-肌素相互作用的能力，而不对受损的相邻肌纤维的潜在混淆影响（当测量单肌肉纤维超结构损伤和肌纤维错位时，可能导致收缩性受损）（图1D）;3） 肌纤维的小直径（±1 μm，图2A）和缺乏膜允许几乎瞬间钙扩散到沙状物。此外，如果肌黄种人存在结构损伤，它们很可能在隔离期间或实验期间断裂。因此，评估肌纤维收缩是研究肌肉收缩的基本机制，并了解干扰行为-肌蛋白相互作用是否是由沙康蛋白突变引起的肌肉疾病的主要原因的优雅方法。
该协议提出了一个新开发的设置，以确定肌纤维的收缩性，其中结合了具有纳米牛顿分辨率的悬臂力探头（即Opiforce）。该力探针基于干涉测量原理。干涉测量允许使用相对僵硬的直性插性。这使得测量力与悬臂的小偏转，接近等轴测收缩的肌醇。该探头允许评估低被动和主动力，由从不同的肌肉活检分离出的单个肌黄素和主动力，包括来自人类受试者的活检，具有很高的信号与噪声比。此设置中集成的光学悬臂力探头基于 Fabry-Pérot 干涉仪12。干涉仪可检测光纤与安装在铁杉上的镀金悬臂之间的小位移（图3）。光纤和悬臂之间的间隙称为法布里-佩罗腔。使用两种胶涂层玻璃安装纤维安装在探头和压电电机之间。肌异的力可以从干涉仪数据中数学上产生。干涉测量基于两个或两个多波的叠加或干扰（在此设置中，三个光波）。波长在 1，528.77~1，563.85 nm 之间的激光从干涉仪发射并通过光纤发送。在探头中，光在光纤和介质之间的接口上反射1（图3A）;2） 在介质和悬臂的接口（图3B）;和3）在悬臂的金属和黄金涂层之间的接口（图3C）。接口 A 和 B 上的反射取决于探头被淹没介质的折射率 （n）。光线由三个叠加反射组成，返回干涉仪中的光电二极管。光电二极管测量光的强度，这是三个叠加反射的干扰模式的结果。当通过激活或拉伸肌黄种人产生收缩力时，肌骨力会拉上悬臂。此运动更改型腔大小（d）， 因此更改适合型腔的波长数。悬臂反射的光将具有不同的相位，从而产生不同的干扰模式。光电二极管将干扰模式强度的这种变化记录为伏特的变化。随后，考虑到悬臂刚度，根据这种变化计算了肌黄热化力生成。力探针由制造商通过推动安装针的尖端，连接到悬臂的自由手端，对称量秤，同时保持悬臂的弯曲等于读出激光13波长的倍数。因此，干涉测量是一种高度敏感的方法，用于检测距离的小变化，从而能够测量纳米牛顿分辨率的力。此分辨率能够评估具有高信噪比的 myofibrillar 力生产。虽然传统的干涉测量将测量范围限制在干涉曲线的线性部分，但使用锁定放大器和激光波长调制克服了这一限制14。这一点在讨论部分进行了更详细的解释。
为了测量肌磷气活性张力，采用了快速灌注系统，使肌磷酸化液暴露在钙溶液中（图4A）。快速步进灌注系统可在 10 ms 内进行溶液更改。由于其直径小，钙扩散到肌磷几乎瞬间。因此，该系统特别适合测量激活期间和放松期间释放的机蛋白-明蛋白结合率。激活速率 （kACT）和松弛 （kREL） 可以从激活松弛曲线中确定。此外，通过将肌磷暴露给浓度增加的钙溶液，可以确定力-钙关系和钙敏感性。
此外，压电长度电机能够快速拉伸和缩短肌黄种人。这提供了研究肌黄油的粘弹性特性（即被动张力）的可能性，以及执行快速缩短和重新拉伸的肌黄油，以确定张力重建的速度（kTR）。从主动和被动张力实验中检索到的参数可以通过沙康蛋白中的基因突变来改变。
此定制设置用于测量与健康人、患者和小鼠骨骼肌分离的肌纤维的主动和被动收缩特性。
Protocol
Representative Results
Discussion
描述是一种协议，用于评估从人或动物骨骼肌组织中分离出的肌骨的收缩功能。查万等人之前曾描述过这种装置的力分辨率。简言之，它由检测纤维和悬臂之间形成的Fabry-Pérot腔长度的随机波动决定，这些空腔产生读出输出（以V表示）时噪声的主导部分，乘以偏转灵敏度（以m/V表示）和悬臂的弹簧常数（以N/m表示），从而产生力噪声。在我们的设置中，在读出输出时，在 1，000 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该项目由AFM-Telethon和Nemaline Myopath基金会建设力量资助。作者希望承认本文中提到的产品的创建者 IONOptix Inc.
Materials
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
Referencias
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