Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der kontraktilen Eigenschaften von gestreiften Muskelmyofibrils mit Nano-Newton-Auflösung vorgestellt. Das Protokoll verwendet ein Setup mit einer Interferometrie-basierten optischen Kraftsonde. Dieses Setup erzeugt Daten mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht die Beurteilung der kontraktilen Kinetik von Myofibrils.
Abstract
Gestreifte Muskelzellen sind für die Aktivität von Mensch und Tier unverzichtbar. Einzelne Muskelfasern bestehen aus Myofibrillen, die aus seriell verbundenen Sarkomen bestehen, den kleinsten kontraktilen Einheiten im Muskel. Sarkomische Dysfunktion trägt zur Muskelschwäche bei Patienten mit Mutationen in Genen bei, die für sarkomerische Proteine kodieren. Die Untersuchung der Myofibril-Mechanik ermöglicht die Beurteilung von Actin-Myosin-Wechselwirkungen ohne mögliche verwirrende Auswirkungen von beschädigten, benachbarten Myofibrils bei der Messung der Kontraktilität einzelner Muskelfasern. Ultrastrukturelle Schäden und Fehlausrichtung von Myofibrils können zu einer beeinträchtigungen Kontraktilität beitragen. Wenn strukturelle Schäden in den Myofibrils vorhanden sind, brechen sie wahrscheinlich während des Isolationsverfahrens oder während des Experiments. Darüber hinaus liefern Studien an Myofibrils die Beurteilung von Actin-Myosin-Wechselwirkungen in Gegenwart der geometrischen Zwänge der Sarkome. Beispielsweise können Messungen in Myofibrils klären, ob myofibrillare Dysfunktion die primäre Wirkung einer Mutation in einem sarkomischen Protein ist. Darüber hinaus ist die Perfusion mit Calciumlösungen oder Verbindungen aufgrund des geringen Durchmessers des Myofibrils fast sofort. Dies macht myofibrils hervorragend geeignet, um die Aktivierungs- und Entspannungsraten während der Kraftproduktion zu messen. Das in diesem Papier beschriebene Protokoll verwendet eine optische Kraftsonde, die auf dem Prinzip eines Fabry-Pérot-Interferometers basiert, das kräfte im Nano-Newton-Bereich messen kann, gekoppelt an einen Piezolängenmotor und ein Schnellschritt-Perfusionssystem. Dieses Setup ermöglicht das Studium der myofibril Mechanik mit hochauflösenden Kraftmessungen.
Introduction
Gestreifte Muskelzellen sind für den Alltag unverzichtbar. Die Bewegung der Gliedmaßen, die Atemfunktion und die Pumpbewegung des Herzens verlassen sich auf die Kraft, die von Muskelzellen erzeugt wird. Skelettmuskel besteht aus Muskelfascicles, die Bündel von einzelnen Muskelfasern enthalten (Abbildung 1A). Diese Muskelfasern bestehen aus Myofibrillen, die durch seriell verknüpfte Sarkome gebildet werden (Abbildung 1B,D). Die Sarkome enthalten dünne und dicke Filamente. Diese bestehen in erster Linie aus Ketten von Aktin- bzw. Myosinmolekülen (Abbildung 1B). Actin-Myosin-Wechselwirkungen sind verantwortlich für die krafterzeugende Kapazität der Muskeln. Patienten mit Mutationen in Genen, die für sarmere Proteine wie Nebulin, Actin und Troponin T kodieren, leiden an Muskelschwäche aufgrund kontraktiler Dysfunktion1.
Die Qualität der Muskelkontraktilität kann auf verschiedenen Ebenen der Organisation untersucht werden, von in vivo ganze Muskeln zu Actin-Myosin-Wechselwirkungen in In-vitro-Motilität assays. In den letzten Jahrzehnten haben mehrere Forschungsgruppen Setups entwickelt, um die Kontraktilität einzelner Myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,,10zu bestimmen. Diese Setups basieren auf der Detektion von Veränderungen der Laserablenkung durch einen Ausleger (d.h. optische Strahlverformung), die durch die Kontraktion des Myofibrils verursacht wird (Details siehe Labuda et al.11). Obwohl die Bestimmung der kontraktilen Funktion von Myofibrils einige Einschränkungen aufweist (z.B. fehlt die Dynamik der Anregungs-Kontraktions-Kopplungsprozesse, die vor den Myofibrils liegen), gibt es mehrere Vorteile für diesen Ansatz. Dazu gehören: 1) die Fähigkeit, Actin-Myosin-Wechselwirkungen in Gegenwart der geometrischen Abhängigkeiten der Sarkome zu bewerten; 2) die Fähigkeit, Actin-Myosin-Wechselwirkungen ohne mögliche verwirrende Auswirkungen von beschädigten, benachbarten Myofibrils zu bewerten (bei der Messung der Kontraktilität von einzelnen Muskelfasern ultrastrukturelle Schäden und Fehlausrichtung von Myofibrils könnte zu einer beeinträchtigten Kontraktilität beitragen) (Abbildung 1D); 3) der kleine Durchmesser von Myofibrils (1 m, Abbildung 2A) und der Mangel an Membranen ermöglichen eine fast sofortige Calciumdiffusion in die Sarkome. Wenn strukturelle Schäden in den Myofibrils vorhanden sind, brechen sie wahrscheinlich während ihrer Isolation oder während des Experiments. Daher ist die Beurteilung der myofibrilKontraktilität eine elegante Methode, um die grundlegenden Mechanismen der Muskelkontraktion zu studieren und zu verstehen, ob gestörte Actin-Myosin-Wechselwirkungen die primäre Ursache für Muskelerkrankungen sind, die durch Mutationen in sarkomerischen Proteinen verursacht werden.
Dieses Protokoll stellt ein neu entwickeltes Setup dar, um die Kontraktilität von Myofibrils zu bestimmen, die eine Freischwinger-Kraftsonde mit Nano-Newton-Auflösung (d. h. Optiforce) enthalten. Diese Kraftsonde basiert auf dem Prinzip der Interferometrie. Die Interferometrie ermöglicht die Verwendung relativ steifer Ausleger. Dies macht es möglich, Kraft mit wenig Ablenkung des Auslegers zu messen, nähern sich isometrischen Kontraktionen des Myofibrils. Die Sonde ermöglicht die Beurteilung niedriger passiver und aktiver Kräfte, die von einem einzelnen Myofibril erzeugt werden, das aus verschiedenen Muskelbiopsien, einschließlich von Menschen, mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis isoliert wird. Die in diesem Setup integrierte optische Auslegerkraftsonde basiert auf einem Fabry-Pérot Interferometer12. Das Interferometer erkennt kleine Verschiebungen zwischen einer Glasfaser und einem goldbeschichteten Ausleger, der auf einer Ferrule montiert ist (Abbildung 3). Der Spalt zwischen der Glasfaser und dem Ausleger wird Fabry-Pérot Hohlraum genannt. Myofibrils werden zwischen Sonde und Piezomotor mit zwei leimbeschichteten Glasfasern montiert. Die vom Myofibril erzeugte Kraft kann mathematisch aus den Interferometerdaten abgeleitet werden. Die Interferometrie basiert auf der Überlagerung oder Interferenz von zwei oder mehr Wellen (in diesem Setup drei Lichtwellen). Laserlicht mit einer Wellenlänge zwischen 1.528,77–1.563,85 nm wird vom Interferometer emittiert und durch die Optische Faser gesendet. In der Sonde wird das Licht 1) an der Schnittstelle zwischen der Optischen Faser und dem Medium reflektiert (Abbildung 3A); 2) an der Schnittstelle des Mediums und des Auslegers (Abbildung 3B); und 3) an der Schnittstelle zwischen der Metall- und Goldbeschichtung des Auslegers (Abbildung 3C). Die Reflexion an den Schnittstellen A und B ist abhängig vom Brechungsindex (n) des Mediums, in das die Sonde eingetaucht ist. Das Licht, bestehend aus den drei überlagerten Reflexionen, kehrt zu einer Photodiode im Interferometer zurück. Die Photodiode misst die Intensität des Lichts, die das Ergebnis des Interferenzmusters der drei überlagerten Reflexionen ist. Wenn kontraktile Kraft durch Aktivieren oder Dehnen eines Myofibril erzeugt wird, zieht das Myofibril auf den Ausleger. Diese Bewegung ändert die Hohlraumgröße(d) und damit die Anzahl der Wellenlängen, die in den Hohlraum passen. Das licht reflektiert am Ausleger hat eine andere Phase, was zu einem anderen Interferenzmuster führt. Die Photodiode zeichnet diese Änderung der Interferenzmusterintensität als Eine Änderung der Volt auf. Anschließend wird aus dieser Änderung die Myofibril-Krafterzeugung unter Berücksichtigung der Auslegersteifigkeit berechnet. Die Kraftsonde wird vom Hersteller kalibriert, indem die Spitze der Montagenadel, die am freien Handende des Auslegers befestigt ist, gegen eine Waage gedrückt wird, während die Biegung des Auslegers einem Vielfachen der Wellenlänge des Ausleselasers13entspricht. Daher ist die Interferometrie eine hochempfindliche Methode, um kleine Entfernungsänderungen zu erkennen, die eine Messung von Kräften mit Nano-Newton-Auflösung ermöglichen. Diese Auflösung ermöglicht die Beurteilung der myofibrillaren Kraftproduktion mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Während die traditionelle Interferometrie den Messbereich auf den linearen Teil der Interferenzkurve begrenzt, überwindet die Verwendung eines Einsperrverstärkers und die Modulation der Laserwellenlänge diese Einschränkung14. Dies wird im Diskussionsteil ausführlicher erläutert.
Um die myofibril aktive Spannung zu messen, wurde ein schnelles Perfusionssystem eingebaut, um das Myofibril Calciumlösungen auszusetzen (Abbildung 4A). Das schnelle Perfusionssystem ermöglicht Lösungsänderungen innerhalb von 10 ms. Aufgrund ihres geringen Durchmessers ist die Kalziumdiffusion in die Myofibrils fast augenblicklich. Daher eignet sich dieses System besonders zur Messung der Aktin-Myosin-Bindungsraten während der Aktivierung und Freisetzung während der Entspannung. Die Aktivierungsrate (kACT) und Entspannung (kREL) kann aus den Aktivierungs-Entspannungskurven bestimmt werden. Auch durch die Exposition der Myofibrils gegenüber Kalziumlösungen mit steigender Konzentration kann die Kraft-Calcium-Beziehung und Kalziumempfindlichkeit bestimmt werden.
Darüber hinaus ermöglicht ein Piezolängenmotor eine schnelle Dehnung und Verkürzung des Myofibrils. Dies bietet die Möglichkeit, die viskoelastischen Eigenschaften (d.h. passive Spannung) des Myofibrils zu untersuchen, sowie eine schnelle Verkürzung und Redehnung des Myofibrils durchzuführen, um die Spannungsrate der Neuentwicklung (kTR) zu bestimmen. Die Parameter, die sowohl aus aktiven als auch aus passiven Spannungsexperimenten gewonnen werden, können durch Genmutationen in einem sarkomischen Protein verändert werden.
Diese maßgeschneiderte Einrichtung wurde verwendet, um die aktiven und passiven kontraktilen Eigenschaften von Myofibrils zu messen, die aus gesunden menschlichen, geduldigen und Mausskelettmuskeln isoliert sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beschrieben ist ein Protokoll zur Beurteilung der kontraktilen Funktion von Myofibrils, die aus menschlichen oder tierischen Skelettmuskelgeweben isoliert sind. Die Kraftauflösung dieses Setups wurde bereits von Chavan et al.12beschrieben. Kurz gesagt, wird durch die zufälligen Schwankungen der Länge der Fabry-Pérot-Kavität zwischen der Detektionsfaser und dem Ausleger gebildet, die den dominanten Teil des Rauschens am Ausgang der Auslese erzeugen (ausgedrückt in V), die, multipliziert mit d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde von AFM-Telethon und A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies finanziert. Die Autoren möchten den Schöpfer der in diesem Artikel genannten Produkte, IONOptix Inc.
Materials
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
Referencias
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