Myofibrils isoleren van skeletspierbiopten en het bepalen van contractielfunctie met een Nano-Newton Resolution Force Transducer
Summary
Hier gepresenteerd is een protocol om de contractiele eigenschappen van gestreepte spier myofibrils met nano-Newton resolutie te beoordelen. Het protocol maakt gebruik van een setup met een interferometrie-gebaseerde, optische kracht sonde. Deze opstelling genereert gegevens met een hoge signaal-ruisverhouding en maakt de beoordeling van de contractiele kinetiek van myofibrils mogelijk.
Abstract
Gestreepte spiercellen zijn onmisbaar voor de activiteit van mens en dier. Enkele spiervezels bestaan uit myofibrils, die bestaan uit serieel verbonden sarcomeres, de kleinste contractiele eenheden in de spier. Sarcomerische disfunctie draagt bij aan spierzwakte bij patiënten met mutaties in genen die coderen voor sarcomerische eiwitten. De studie van myofibril mechanica maakt het mogelijk voor de beoordeling van actin-myosine interacties zonder mogelijke verstorende effecten van beschadigde, aangrenzende myofibrils bij het meten van de contractiliteit van enkele spiervezels. Ultrastructurele schade en verkeerde uitlijning van myofibrils kunnen bijdragen tot verminderde contractiliteit. Als er structurele schade aanwezig is in de myofibrils, breken ze waarschijnlijk tijdens de isolatieprocedure of tijdens het experiment. Bovendien geven studies in myofibrils de beoordeling van actin-myosine interacties in aanwezigheid van de geometrische beperkingen van de sarcomeres. Metingen in myofibrils kunnen bijvoorbeeld duidelijk maken of myofibrillar disfunctie het primaire effect is van een mutatie in een sarcomerisch eiwit. Bovendien is perfusie met calciumoplossingen of verbindingen bijna direct te wijten aan de kleine diameter van de myofibril. Dit maakt myofibrils bij uitstek geschikt om de snelheid van activering en ontspanning tijdens de krachtproductie te meten. Het protocol beschreven in dit document maakt gebruik van een optische kracht sonde gebaseerd op het principe van een Fabry-Pérot interferometer in staat om krachten te meten in de nano-Newton bereik, gekoppeld aan een piëzo lengte motor en een snelle perfusie systeem. Deze setup maakt het mogelijk om myofibril mechanica met hoge resolutie krachtmetingen te bestuderen.
Introduction
Gestreepte spiercellen zijn onmisbaar voor dagelijkse activiteiten. Limb beweging, ademhalingsfunctie, en de pompende beweging van het hart vertrouwen op de kracht gegenereerd door spiercellen. Skeletspier bestaat uit spiersfalo’s met bundels van enkele spiervezels(figuur 1A). Deze spiervezels bestaan uit myofibrils, die worden gevormd door serieel verbonden sarcomeres (figuur 1B,D). De sarcomeres bevatten dunne en dikke filamenten. Deze bestaan voornamelijk uit ketens van actine- en myosinemoleculen (figuur 1B). Actin-myosine interacties zijn verantwoordelijk voor de kracht-genererende capaciteit van de spier. Patiënten met mutaties in genen die coderen voor sarcomerische eiwitten, zoals neveline, actine en troponine T, lijden aan spierzwakte als gevolg van contractieldisfunctie1.
De kwaliteit van spiercontractiliteit kan worden bestudeerd op verschillende niveaus van organisatie, variërend van in vivo hele spieren tot actin-myosine interacties in in vitro motility testen. In de afgelopen decennia hebben verschillende onderzoeksgroepen opstellingen ontwikkeld om de contractiliteit van individuele myofibrils2,3,4,5,6,7,,8,98,,10te bepalen ., Deze opstellingen zijn gebaseerd op de detectie van veranderingen in laserafbuiging van een cantilever (d.w.z. optische straalafbuiging) veroorzaakt door de samentrekking van de myofibril (zie Labuda et al.11). Hoewel het bepalen van de contractiele functie van myofibrils een aantal beperkingen heeft (bijvoorbeeld de dynamiek van de excitatie-contractiekoppelingsprocessen die stroomopwaarts van de myofibrils zijn, ontbreken er meerdere voordelen aan deze aanpak. Deze omvatten: 1) de mogelijkheid om actin-myosine interacties te beoordelen in aanwezigheid van de geometrische beperkingen van de sarcomeres; 2) de mogelijkheid om actin-myosine interacties te beoordelen zonder mogelijke verstorende effecten van beschadigde, aangrenzende myofibrils (bij het meten van de contractiliteit van enkele spiervezels ultrastructurale schade en verkeerde uitlijning van myofibrils zou kunnen bijdragen tot verminderde contractiliteit) (Figuur 1D); 3) de kleine diameter van myofibrils (~ 1 μm, figuur 2A) en het ontbreken van membranen zorgen voor bijna onmiddellijke calciumdiffusie in de sarcomeres. Bovendien, als structurele schade aanwezig is in de myofibrils, ze waarschijnlijk breken tijdens hun isolatie of tijdens het experiment. Vandaar dat het beoordelen van myofibril contractiliteit een elegante methode is om de basismechanismen van spiercontractie te bestuderen en te begrijpen of verstoorde actin-myosine-interacties de primaire oorzaak zijn van spierziekte veroorzaakt door mutaties in sarcomerische eiwitten.
Dit protocol presenteert een nieuw ontwikkelde setup om de contractiliteit van myofibrils met een cantilever kracht sonde met nano-Newton resolutie (dwz, Optiforce) te bepalen. Deze force probe is gebaseerd op het principe van interferometrie. Interferometrie maakt het gebruik van relatief stijve cantilevers mogelijk. Dit maakt het mogelijk om kracht te meten met weinig afbuiging van de cantilever, naderende isometrische samentrekkingen van de myofibril. De sonde maakt het mogelijk om lage passieve en actieve krachten te beoordelen die worden geproduceerd door een enkele myofibril geïsoleerd van verschillende spierbiopten, waaronder die van menselijke proefpersonen, met een hoge signaal-ruisverhouding. De optische cantilever force probe die in deze opstelling is opgenomen is gebaseerd op een Fabry-Pérot interferometer12. De interferometer detecteert kleine verplaatsingen tussen een optische vezel en een goudgecoate cantilever gemonteerd op een ferrule (figuur 3). De kloof tussen de optische vezel en de cantilever wordt de Fabry-Pérot holte genoemd. Myofibrils zijn gemonteerd tussen de sonde en piëzo motor met behulp van twee lijm-gecoate glas montage vezels. De kracht geproduceerd door de myofibril kan wiskundig worden afgeleid uit de interferometer gegevens. Interferometrie is gebaseerd op de superpositie of interferentie van twee of meer golven (in deze opstelling drie lichtgolven). Laserlicht met een golflengte tussen 1.528,77–1.563,85 nm wordt uitgestoten door de interferometer en wordt via de glasvezel verzonden. In de sonde wordt het licht gereflecteerd 1) op de interface tussen de optische vezel en het medium (figuur 3A); 2) op de interface van het medium en de cantilever (Figuur 3B); en 3) op de interface tussen de metalen en gouden coating van de cantilever (Figuur 3C). De reflectie bij interface A en B is afhankelijk van de brekingsindex(n)van het medium waarin de sonde wordt ondergedompeld. Het licht, bestaande uit de drie bovenliggende reflecties, keert terug naar een fotodiode in de interferometer. De fotodiode meet de intensiteit van het licht, wat het gevolg is van het interferentiepatroon van de drie boven elkaar geplaatste reflecties. Wanneer contractielkracht wordt gegenereerd door het activeren of uitrekken van een myofibril, trekt de myofibril aan de cantilever. Deze beweging verandert de spouwgrootte(d) en dus het aantal golflengten dat in de holte past. Het licht gereflecteerd op de cantilever zal een andere fase hebben, wat resulteert in een ander interferentiepatroon. De fotodiode registreert deze verandering van interferentie patroon intensiteit als een verandering in Volts. Vervolgens wordt myofibril krachtgeneratie berekend op basis van deze verandering, rekening houdend met de cantilever stijfheid. De krachtsonde wordt door de fabrikant gekalibreerd door het puntje van de montagenaald, bevestigd aan het vrije handeind van de cantilever, tegen een weegschaal te duwen terwijl het buigen van de cantilever gelijk blijft aan een veelvoud van de golflengte van de uitleeslaser13. Interferometrie is dus een zeer gevoelige methode om kleine veranderingen in afstand te detecteren, waardoor krachten met een nano-Newtonresolutie kunnen worden gemeten. Deze resolutie maakt de beoordeling van myofibrillar kracht productie met een hoge signaal-ruisverhouding. Terwijl traditionele interferometrie het bereik van metingen beperkt tot het lineaire deel van de interferentiecurve, overwint het gebruik van een lock-in versterker en modulatie van de lasergolflengte deze beperking14. Dit wordt nader toegelicht in de discussiesectie.
Om de actieve spanning van myofibril te meten, werd een fast-step perfusiesysteem geïntegreerd om de myofibril bloot te stellen aan calciumoplossingen(figuur 4A). Het snelle perfusiesysteem zorgt ervoor dat oplossingswijzigingen binnen 10 ms kunnen plaatsvinden. Vanwege hun kleine diameter is calciumdiffusie in de myofibrils bijna onmiddellijk. Daarom is dit systeem bijzonder geschikt voor het meten van de snelheid van actin-myosine binding tijdens activering en release tijdens ontspanning. De snelheid van activering (kACT)en ontspanning (kREL)kunnen worden bepaald aan de hand van de activatie-ontspanningscurven. Ook, door het blootstellen van de myofibrils aan calcium oplossingen van toenemende concentratie, de kracht-calcium relatie en calcium gevoeligheid kan worden bepaald.
Bovendien maakt een piëzolengtemotor het snel uitrekken en verkorten van de myofibril mogelijk. Dit biedt de mogelijkheid om de visco-elastische eigenschappen (d.w.z. passieve spanning) van de myofibril te bestuderen, evenals het uitvoeren van een snelle verkorting en restretch van de myofibril om de snelheid van spanningsherontwikkeling (kTR)te bepalen. De parameters die uit zowel actieve als passieve spanningsexperimenten worden opgehaald, kunnen worden gewijzigd door genmutaties in een sarcomerisch eiwit.
Deze op maat gemaakte setup werd gebruikt om de actieve en passieve contractiele kenmerken van myofibrils geïsoleerd van gezonde menselijke, geduldige en muis skeletspieren te meten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beschreven is een protocol om de contractiele functie van myofibrils geïsoleerd van menselijke of dierlijke skeletspierweefsels te beoordelen. De krachtresolutie van deze opstelling is al eerder beschreven door Chavan et al.12. Kortom, het wordt bepaald door de willekeurige schommelingen van de lengte van de Fabry-Pérot holte gevormd tussen de detectievezel en de cantilever, die het dominante deel van het geluid produceren bij de uitgang van de uitlezing (uitgedrukt in V) die, vermenigvuldigd me…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gefinancierd door AFM-Telethon en A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies. De auteurs willen de maker van de producten die in dit artikel, IONOptix Inc.
Materials
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
Referencias
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).
- Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
- Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
- Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
- de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
- Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
- Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
- Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
- Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
- Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
- van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
- Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
- Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
- Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
- Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
- Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
- Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).
