İskelet Kas Biyopsilerinden Miyofibrillerin İzlenmesi ve Nano-Newton Çözünürlük Transdüseri ile Kontraktil Fonksiyonun Belirlenmesi
Summary
Burada nano-Newton çözünürlüğü ile striated kas miyofibrils kontraktil özelliklerini değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Protokolde interferometri tabanlı optik kuvvet sondası içeren bir kurulum uyguluyor. Bu kurulum yüksek sinyal-gürültü oranı ile veri üretir ve miyofibrils kontraktil kinetiği değerlendirilmesini sağlar.
Abstract
Burlu kas hücreleri insan ve hayvanların aktivitesi için vazgeçilmezdir. Tek kas lifleri miyofibrils oluşur, hangi seri bağlı sarcomeres oluşur, kas en küçük kontraktil birimleri. Sarkoerik disfonksiyon sarkoerik proteinler için kodlama genmutasyonları olan hastalarda kas güçsüzlüğüne katkıda bulunur. Miyofibril mekaniğinin çalışması, tek kas liflerinin kontraktilitesini ölçerken hasarlı, bitişik miyofibrillerin potansiyel kafa karıştırıcı etkileri olmadan aktin-miyozin etkileşimlerinin değerlendirilmesine olanak sağlar. Aşırı yapısal hasar ve miyofibrillerin yanlış hizalanması kasıldaş bozukluğuna neden olabilir. Miyofibrillerde yapısal hasar varsa, muhtemelen izolasyon işlemi sırasında veya deney sırasında kırılırlar. Ayrıca, miyofibrils çalışmaları sarcomeres geometrik kısıtlamalar varlığında aktin-miyozin etkileşimleri değerlendirilmesi sağlar. Örneğin, miyofibrils ölçümleri miyofibrillar disfonksiyon sarkoerik protein bir mutasyonun birincil etkisi olup olmadığını açıklayabilir. Buna ek olarak, kalsiyum çözeltileri veya bileşikleri ile perfüzyon miyofibril küçük çapı nedeniyle neredeyse anında. Bu da miyofibrilleri kuvvet üretimi sırasında aktivasyon ve gevşeme oranlarını ölçmek için son derece uygun hale getirir. Bu yazıda açıklanan protokol, bir piezo uzunluk motoru ve hızlı adım perfüzyon sistemi ile birleştiğinde, nano-Newton aralığındaki kuvvetleri ölçebilen bir Fabry-Pérot interferometre prensibine dayalı bir optik kuvvet sondası kullanır. Bu kurulum, yüksek çözünürlüklü kuvvet ölçümleri ile miyofibril mekaniğinin incelenmesini sağlar.
Introduction
Burlu kas hücreleri günlük yaşam aktiviteleri için vazgeçilmezdir. Ekstremite hareketi, solunum fonksiyonu ve kalbin pompalama hareketi kas hücreleri tarafından üretilen kuvvet güveniyor. İskelet kası, tek kas liflerinin demetleri içeren kas fasiküllerinden oluşur (Şekil 1A). Bu kas lifleri seri bağlı sarcomeres tarafından oluşturulan miyofibrils oluşur (Şekil 1B,D). Sarcomeres ince ve kalın filamentler içerir. Bunlar öncelikle sırasıyla aktin ve miyozin molekülzincirlerinden oluşur (Şekil 1B). Aktin-miyozin etkileşimleri kas kuvvet üreten kapasitesi sorumludur. Nebulin, aktin ve troponin T gibi sarkoerik proteinleri kodlayan genlerde mutasyonlar olan hastalar, kontraktil disfonksiyon nedeniyle kas güçsüzlüğü muzdarip1.
Kas kontraktilite kalitesi in vivo bütün kaslar in vitro motilite tahlilleri actin-miyozin etkileşimleri arasında değişen, organizasyonun çeşitli düzeylerde çalışılabilir. Son yıllarda, çeşitli araştırma grupları,bireysel myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,10sözleşme belirlemek için kurulumları geliştirdik . Bu kurulumlar, miyofibrilin kasılmasından kaynaklanan bir kantileverden (yani optik ışın sapması) lazer sapmasındaki değişikliklerin algılanmasına dayanır (ayrıntılar için bkz. Labuda ve ark.11). Myofibrils kontraktil fonksiyonu belirlenmesi bazı sınırlamalar (örneğin, miyofibrils upstream olan uyarma-daralma kaplin süreçlerinin dinamikleri eksik olmasına rağmen), bu yaklaşımın birden fazla avantajı vardır. Bunlar şunlardır: 1) sarcomeres geometrik kısıtlamaları varlığında aktin-miyozin etkileşimleri değerlendirmek için yeteneği; 2) hasarlı, bitişik miyofibrillerin potansiyel kafa karıştırıcı etkileri olmadan aktin-miyozin etkileşimlerini değerlendirme yeteneği (tek kas liflerinin kontraktilitesini ölçerken ultrayapısal hasar ve miyofibrillerin yanlış hizalanması kasılvesiyetin bozulmasına neden olabilir)(Şekil 1D); 3) miyofibrillerin küçük çapı (~1 μm, Şekil 2A)ve zar eksikliği sarcomeres içine neredeyse anında kalsiyum difüzyon için izin verir. Ayrıca, miyofibrillerde yapısal hasar varsa, muhtemelen izolasyonları sırasında veya deney sırasında kırılırlar. Bu nedenle, miyofibril kontraksiyonu değerlendirmek kas kasılmasının temel mekanizmalarını incelemek ve rahatsız edici aktin-miyozin etkileşimlerinin sarkoerik proteinlerdeki mutasyonların neden olduğu kas hastalığının birincil nedeni olup olmadığını anlamak için kullanılan zarif bir yöntemdir.
Bu protokol, nano-Newton çözünürlüğüne sahip bir kantil kuvvet sondası (yani Optiforce) içeren miyofibrillerin kontraktilliğini belirlemek için yeni geliştirilmiş bir kurulum sunar. Bu kuvvet sondası interferometri prensibine dayanır. İnterferometri nispeten sert kantilevers kullanımını sağlar. Bu, miyofibrilin izometrik kasılmaları yaklaşırken, kantilever çok az sapma ile kuvvet ölçmek mümkün kılar. Prob, insan denekler de dahil olmak üzere farklı kas biyopsilerinden izole edilmiş tek bir miyofibril tarafından üretilen düşük pasif ve aktif kuvvetlerin yüksek sinyal-gürültü oranı ile değerlendirilmesini sağlar. Bu kurulumda yer alan optik kantilkuvvet prob fabry-Pérot interferometre12dayanmaktadır. İnterfermetre, optik fiber ile bir ferrule üzerine monte edilmiş altın kaplı bir kantil arasındaki küçük yer değiştirmeleri algılar (Şekil 3). Optik fiber ve kantilever arasındaki boşluk Fabry-Pérot boşluğu denir. Miyofibrils prob ve piezo motor arasında iki tutkal kaplı cam montaj lifleri kullanılarak monte edilir. Miyofibril tarafından üretilen kuvvet matematiksel olarak interferometre verilerinden elde edilebilir. İnterferometri iki veya daha fazla dalganın (bu kurulumda üç ışık dalgası) süperpozisyonuna veya girişimine dayanır. 1,528.77-1.563.85 nm arasında dalga boyuna sahip lazer ışığı interferometreden yayılır ve optik fiber üzerinden gönderilir. Sondada, ışık yansıtılır 1) optik fiber ve ortam arasındaki arabirimde(Şekil 3A); 2) orta ve cantilever arayüzünde (Şekil 3B); ve 3) kantilever metal ve altın kaplama arasındaki arabirimde (Şekil 3C). A ve B arabirimindeki yansıma, sondanın batırıldığı ortamın kırılma indisi(n)bağlıdır. Üç üst üste yerleştirilmiş yansımadan oluşan ışık, interferometredeki bir fotodiyota geri döner. Fotodiyot, üç üst üste yerleştirilmiş yansımanın girişim deseninin sonucu olan ışığın yoğunluğunu ölçer. Bir miyofibril etkinleştirilerek veya gerilerek kontraktil kuvvet oluşturulduğunda, miyofibril kantilever çeker. Bu hareket kavite boyutunu(d) ve dolayısıyla, kavite sığan dalga boylarının sayısını değiştirir. Kantilever yansıyan ışık farklı bir faz alacaktır, farklı bir girişim deseni ile sonuçlanan. Fotodiyot, bu parazit desen yoğunluğu değişimini Volt’taki bir değişiklik olarak kaydeder. Daha sonra, miyofibril kuvvet üretimi bu değişiklikten hesaplanır, cantilever sertliği dikkate alınarak. Kuvvet probu, montaj iğnesinin ucunu iterek, kantilin serbest teslim ucuna, bir tartım ölçeğine karşı tartılarak, kantilin bükülmesini okumalazer13’ündalga boyunun bir katına eşit tutarak kalibre edilir. Bu nedenle, interferometri nano-Newton çözünürlüğü ile kuvvetlerin ölçümü için izin, mesafe küçük değişiklikleri tespit etmek için son derece hassas bir yöntemdir. Bu çözünürlük, yüksek sinyal-gürültü oranı ile miyofibrillar kuvvet üretiminin değerlendirilmesini sağlar. Geleneksel interferometri, ölçüm aralığını girişim eğrisinin doğrusal kısmına sınırlarken, kilitleyici amplifikatör ve lazer dalga boyu modülasyonu kullanılarak bu sınırlamanın üstesindengelin14. Bu tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Miyofibril aktif gerilimi ölçmek için miyofibril’i kalsiyum çözeltilerine maruz bırakmak için hızlı adımlı bir perfüzyon sistemi kurulmuştur(Şekil 4A). Hızlı basamak perfüzyon sistemi, 10 ms içinde çözüm değişikliklerinin gerçekleşmesini sağlar. Küçük çapları nedeniyle miyofibrillere kalsiyum difüzyonu neredeyse anlıktır. Bu nedenle, bu sistem özellikle aktivasyon sırasında aktivasyon ve gevşeme sırasında serbest aktin-miyozin bağlanma oranlarını ölçmek için uygundur. Aktivasyon oranı (kACT)ve gevşeme (kREL)aktivasyon-gevşeme eğrilerinden belirlenebilir. Ayrıca, artan konsantrasyonun kalsiyum çözeltilerine miyofibriller maruz bırakılarak, kuvvet-kalsiyum ilişkisi ve kalsiyum duyarlılığı belirlenebilir.
Ayrıca, bir piezo uzunluğu motor hızlı germe ve miyofibril kısalma sağlar. Bu, miyofibrilin viskoelastik özelliklerini (yani pasif gerilim) inceleme ve gerilim inancını belirlemek için miyofibril’in hızlı bir kısalması ve yeniden gerilmesi (kTR)olanağı sunar. Hem aktif hem de pasif gerilim deneylerinden elde edilen parametreler sarkoerik proteindeki gen mutasyonları ile değiştirilebilir.
Bu özel yapım kurulum sağlıklı insan, hasta ve fare iskelet kas izole miyofibrils aktif ve pasif kontraktil özelliklerini ölçmek için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan insan veya hayvan iskelet kas dokularından izole miyofibrils kontraktil fonksiyondeğerlendirmek için bir protokoldür. Bu kurulumun kuvvet çözünürlüğü daha önce Chavan ve ark.12tarafından tanımlanmıştır. Kısacası, algılama lifi ile kantil arasında oluşan Fabry-Pérot boşluğunun uzunluğundaki rastgele dalgalanmalar tarafından belirlenir, bu da okuma çıkışındaki gürültünün baskın kısmını (V ile ifade edilir) oluşturur, sapma hassasiyeti (m/V ile ifa…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje AFM-Telethon ve Nemaline Myopathies için A Vakfı Yapı Gücü tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar bu makalede belirtilen ürünlerin yaratıcısı kabul etmek istiyorum, IONOptix Inc.
Materials
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
Referencias
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).
- Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
- Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
- Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
- de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
- Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
- Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
- Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
- Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
- Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
- van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
- Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
- Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
- Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
- Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
- Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
- Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).
