Isolamento di Myofibrils da biopsie muscolari scheletriche e determinazione della funzione Contractile con un trasduttore della forza di risoluzione Nano-Newton
Summary
Presentato qui è un protocollo per valutare le proprietà contraili dei miofibrili muscolari striati con risoluzione nano-Newton. Il protocollo utilizza una configurazione con una sonda a forza ottica basata sull’interferometria. Questa configurazione genera dati con un elevato rapporto segnale-rumore e consente la valutazione della cinetica contrattinale delle miofibrils.
Abstract
Le cellule muscolari striate sono indispensabili per l’attività di esseri umani e animali. Le fibre muscolari singole sono costituite da miofibrils, che consistono in sarcomere collegati in serie, le più piccole unità contraili nel muscolo. La disfunzione sarcomerica contribuisce alla debolezza muscolare nei pazienti con mutazioni nei geni che codificano per le proteine sarcomeriche. Lo studio della meccanica miofibrile consente la valutazione delle interazioni actin-myosin senza potenziali effetti confusi di miofibrili danneggiati e adiacenti quando si misura la contrattilità delle singole fibre muscolari. I danni ultrastrutture e il disallineamento dei miofibrils potrebbero contribuire a una contrattura compromessa. Se nei miofibrils sono presenti danni strutturali, probabilmente si rompono durante la procedura di isolamento o durante l’esperimento. Inoltre, gli studi in miofibrils forniscono la valutazione delle interazioni actin-myosin in presenza dei vincoli geometrici dei sarcomere. Ad esempio, le misurazioni nei miofibrils possono chiarire se la disfunzione miofibrillare sia l’effetto primario di una mutazione in una proteina sarcomerica. Inoltre, la perfusione con soluzioni di calcio o composti è quasi istantanea a causa del piccolo diametro del miofibril. Questo rende myofibrils eminentemente adatto a misurare i tassi di attivazione e rilassamento durante la produzione di forza. Il protocollo descritto in questo documento utilizza una sonda di forza ottica basata sul principio di un interferometro Fabry-Pérot in grado di misurare le forze nella gamma nano-Newton, accoppiato a un motore di lunghezza piezo e un sistema di perfusione in fase rapida. Questa configurazione consente lo studio della meccanica miofibrile con misurazioni della forza ad alta risoluzione.
Introduction
Le cellule muscolari striate sono indispensabili per le attività quotidiane. Il movimento degli arti, la funzione respiratoria e il movimento di pompaggio del cuore si basano sulla forza generata dalle cellule muscolari. Il muscolo scheletrico è costituito da fascicle muscolari contenenti fasci di fibre muscolari singole (Figura 1A). Queste fibre muscolari sono costituite da miofibrils, che sono formate da sarcomere collegati in serie (Figura 1B,D). I sarcomere contengono filamenti sottili e spessi. Questi consistono principalmente in catene di molecole di actina e miosina, rispettivamente (Figura 1B). Le interazioni Actin-myosin sono responsabili della capacità di generazione della forza del muscolo. I pazienti con mutazioni nei geni che codificano per le proteine sarcomeriche, come la nebulina, l’actina e la troponina T, soffrono di debolezza muscolare dovuta alla disfunzione contrattile1.
La qualità della contrattilità muscolare può essere studiata a vari livelli di organizzazione, che vanno dai muscoli interi in vivo alle interazioni actin-myosin nei saggi di motilità in vitro. Nel corso degli ultimi decenni, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato configurazioni per determinare la contrattilità dei singoli myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,10. Queste configurazioni si basano sul rilevamento dei cambiamenti nella deflessione laser da un cantilever (cioè, deflessione del fascio ottico) causati dalla contrazione del miofibril (per i dettagli, vedere Labuda et al.11). Anche se determinare la funzione contrattile delle miofibrils ha alcune limitazioni (ad esempio, le dinamiche dei processi di accoppiamento eccitazione-contrazione che sono a monte delle miofibrils sono carenti), ci sono molteplici vantaggi a questo approccio. Questi includono: 1) la capacità di valutare le interazioni actin-myosin in presenza dei vincoli geometrici dei sarcomere; 2) la capacità di valutare le interazioni actin-myosin senza potenziali effetti di confusione di miofibrili danneggiati e adiacenti (quando si misura la contrattilità delle singole fibre muscolari danno ultrastrutturale e disallineamento delle miofibrils potrebbe contribuire a contrarre alterata)(Figura 1D); 3) il piccolo diametro dei miofibrili (1 m, Figura 2A) e la mancanza di membrane consentono una diffusione quasi istantanea del calcio nei sarcomere. Inoltre, se nei miofibrils sono presenti danni strutturali, probabilmente si rompono durante il loro isolamento o durante l’esperimento. Quindi, valutare la contrattilità miofibrile è un metodo elegante per studiare i meccanismi di base della contrazione muscolare e per capire se le interazioni actin-myosin disturbate sono la causa principale della malattia muscolare causata da mutazioni nelle proteine sarcomeche.
Questo protocollo presenta una configurazione di recente sviluppo per determinare la contrattilità delle miofibrils che incorporano una sonda di forza a sbalzo con risoluzione nano-Newton (cioè Optiforce). Questa sonda di forza si basa sul principio dell’interferometria. L’interferometria consente l’uso di sbalzosi relativamente rigidi. Questo permette di misurare la forza con poca deflessione del cantilever, avvicinandosi alle contrazioni isometriche del miofibrile. La sonda consente la valutazione di forze basse passive e attive prodotte da un singolo miofibrile isolato da diverse biopsie muscolari, comprese quelle di soggetti umani, con un elevato rapporto segnale-rumore. La sonda ottica a sbalzo incorporata in questa configurazione si basa su un interferometro Fabry-Pérot12. L’interferometro rileva piccoli spostamenti tra una fibra ottica e un cantilever rivestito in oro montato su un ferrule(Figura 3). Il divario tra la fibra ottica e il cantilever è chiamato cavità Fabry-Pérot. I myofibrils sono montati tra la sonda e il motore piezo utilizzando due fibre di montaggio in vetro rivestite di colla. La forza prodotta dal miofibrile può essere derivata matematicamente dai dati dell’interferometro. L’interferometria si basa sulla sovrapposizione o sull’interferenza di due o più onde (in questa configurazione tre onde luminose). La luce laser con una lunghezza d’onda compresa tra 1.528,77–1.563,85 nm viene emessa dall’interferometro e viene inviata attraverso la fibra ottica. Nella sonda, la luce viene riflessa 1) all’interfaccia tra la fibra ottica e il mezzo (Figura 3A); 2) all’interfaccia del mezzo e del cantilever (Figura 3B); e 3) all’interfaccia tra il rivestimento in metallo e oro del cantilever (Figura 3C). La reflection all’interfaccia A e B dipende dall’indice di rifrazione (n) del mezzo in cui la sonda è sommersa. La luce, costituita dai tre riflessi sovrapposti, ritorna ad un fotodiode nell’interferometro. Il fotodiode misura l’intensità della luce, che è il risultato del modello di interferenza dei tre riflessi sovrapposti. Quando la forza contrattile viene generata attivando o allungando un miofibril, il miofibrile tira sul cantilever. Questo movimento cambia la dimensione della cavità (d) e, di conseguenza, il numero di lunghezze d’onda che si adattano alla cavità. La luce riflessa sul cantilever avrà una fase diversa, con conseguente un diverso modello di interferenza. Il fotodiode registra questo cambiamento di intensità del modello di interferenza come un cambiamento in Volts. Successivamente, la generazione di forza miofibrile viene calcolata da questo cambiamento, tenendo conto della rigidità a sbalzo. La sonda di forza è calibrata dal produttore spingendo la punta dell’ago di montaggio, attaccata all’estremità libera del cantilever, contro una bilancia di pesatura mantenendo la piegatura dello sbalzo pari a un multiplo della lunghezza d’onda del laser di lettura13. Pertanto, l’interferometria è un metodo altamente sensibile per rilevare piccoli cambiamenti di distanza, consentendo la misurazione delle forze con risoluzione nano-Newton. Questa risoluzione consente di valutazione della produzione di forza miofibrillare con un elevato rapporto segnale-rumore. Mentre l’interferometria tradizionale limita la gamma di misure alla parte lineare della curva di interferenza, l’utilizzo di un amplificatore lock-in e della modulazione della lunghezza d’onda lasersupera questa limitazione 14. Ciò è spiegato in modo più dettagliato nella sezione di discussione.
Per misurare la tensione attiva miofibrile, è stato incorporato un sistema di perfusione in fase rapida per esporre il miofibril alle soluzioni di calcio (Figura 4A). Il sistema di perfusione a passo rapido consente di apportare modifiche alla soluzione entro 10 ms. A causa del loro piccolo diametro, la diffusione del calcio nelle miofibrils è quasi istantanea. Pertanto, questo sistema è particolarmente adatto per misurare i tassi di legame actin-myosin durante l’attivazione e il rilascio durante il rilassamento. La velocità di attivazione (kACT) e il rilassamento (kREL) possono essere determinati dalle curve di attivazione-rilassamento. Inoltre, esponendo i miofibrili a soluzioni di calcio di crescente concentrazione, è possibile determinare il rapporto forza-calcio e la sensibilità al calcio.
Inoltre, un motore di lunghezza piezo consente di allungare e accorciare velocemente il miofibril. Ciò offre la possibilità di studiare le proprietà viscoelastiche (cioè la tensione passiva) del miofibril, oltre ad eseguire un rapido accorciamento e riposo del miofibril per determinare il tasso di riqualificazione della tensione (kTR). I parametri recuperati dagli esperimenti di tensione attiva e passiva possono essere alterati da mutazioni genetiche in una proteina sarcomerica.
Questa configurazione su misura è stata utilizzata per misurare le caratteristiche contrattuali attive e passive dei miofibrili isolati dal muscolo scheletrico umano, paziente e topo sano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descritto è un protocollo per valutare la funzione contrattile dei miofibrili isolati dai tessuti muscolari scheletrici umani o animali. La risoluzione della forza di questa configurazione è stata descritta in precedenza da Chavan et al.12. In breve, è determinato dalle fluttuazioni casuali della lunghezza della cavità Fabry-Pérot formata tra la fibra di rilevamento e il cantilever, che producono la parte dominante del rumore all’uscita del readout (espresso in V) che, moltiplicato per la sen…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato da AFM-Telethon e A Foundation Building Strength per le miopatie nemaline. Gli autori desiderano riconoscere il creatore dei prodotti menzionati in questo articolo, IONOptix Inc.
Materials
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
Referencias
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