골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.
Summary
여기에 제시 나노 뉴턴 해상도와 스트라이드 근육 myofibrils의 수축 특성을 평가하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 간섭 계기반 광학 힘 프로브를 사용하여 설정을 사용합니다. 이 설정은 높은 신호 대 잡음 비율로 데이터를 생성하고 myofibrils의 수축 운동의 평가를 가능하게합니다.
Abstract
줄무늬 근육 세포는 인간과 동물의 활동에 필수적입니다. 단일 근육 섬유는 근육에서 가장 작은 수축 단위인 직렬로 연결된 사마페로 구성된 myofibrils로 구성됩니다. 육종 장애는 육종 단백질을 코딩하는 유전자에 있는 돌연변이를 가진 환자에 있는 근육 약점에 기여합니다. myofibril 역학의 연구는 단일 근육 섬유의 수축도 측정 할 때 손상, 인접한 myofibrils의 잠재적 인 혼란 효과없이 액틴 – myosin 상호 작용의 평가를 할 수 있습니다. 근비릴의 초구조적 손상과 정렬 불량은 손상된 수축에 기여할 수 있습니다. 구조적 손상이 myofibrils에 존재하는 경우, 격리 절차 중 또는 실험 중에 파손 될 가능성이 있습니다. 또한, 근시릴의 연구는 사메메레스의 기하학적 제약이 있는 액틴-미오신 상호작용의 평가를 제공한다. 예를 들면, myofibrils에 있는 측정은 근시릴라 기능 장애가 육종 단백질에 있는 돌연변이의 1 차적인 효력인지 를 해명할 수 있습니다. 또한, 칼슘 솔루션 또는 화합물이 있는 관류는 근시릴의 작은 직경으로 인해 거의 즉각적이다. 이것은 myofibrils가 힘 생산 도중 활성화 그리고 이완의 비율을 측정하기 위하여 탁월하게 적합하게 만듭니다. 이 논문에 설명된 프로토콜은 압전 길이 모터와 빠른 단계 의 관류 시스템에 결합된 나노 뉴턴 범위에서 힘을 측정할 수 있는 Fabry-Pérot 간섭계의 원리에 기초하여 광학 력 프로브를 사용합니다. 이 설정을 통해 고해상도 힘 측정을 통해 myofibril 역학을 연구할 수 있습니다.
Introduction
줄무늬 근육 세포는 일상 생활 활동에 필수적입니다. 사지 운동, 호흡 기능 및 심장의 펌핑 운동은 근육 세포에 의해 생성 된 힘에 의존한다. 골격 근은 단일 근육 섬유의 번들을 포함하는 근육 매심으로 구성됩니다(그림 1A). 이러한 근육 섬유는 직렬로 연결된 사코머(그림1B,D)에의해 형성되는 근시브릴로 구성됩니다. 사혜성에는 얇고 두꺼운 필라멘트가 들어 있습니다. 이들은 주로 액틴과 미오신 분자의 사슬로 구성되며, 각각(도 1B). 액틴-미신 상호 작용은 근육의 힘 생성 능력에 대한 책임이 있습니다. 성운, 액틴 및 트로포닌 T와 같은 육종 단백질을 코딩하는 유전자에 돌연변이가있는 환자는 수축 기능 장애1로인한 근육 약화로 고통받고 있습니다.
근육 수축의 품질 조직의 다양 한 수준에서 공부할 수 있습니다., 생체 전체 근육에서 체 외 운동 성 애사에서 actin-myosin 상호 작용에 이르기까지. 지난 수십 년 동안, 몇몇,연구 단은 개별 myofibrils,,2,3,4,45,,5,6,7,8,9,10의수축을 결정하기 위하여 설치를개발했습니다. 이러한 설정은 근시릴의 수축에 의해 유발된 캔틸레버(즉, 광학 빔 편향)로부터 레이저 편향의 변화를 검출하는 데 기초한다(자세한 내용은 라부다 외11참조). 근시 의 수축 기능을 결정하는 데는 몇 가지 한계가 있지만 (예를 들어, 근시 의 상류인 흥분 수축 커플링 프로세스의 역학이 부족함), 이 접근법에는 여러 가지 장점이 있습니다. 여기에는 사메메레스의 기하학적 제약이 있는 경우 액틴-미오신 상호작용을 평가하는 능력; 2) 손상된, 인접한 근막의 잠재적 인 혼동 효과없이 액틴 – 미오신 상호 작용을 평가 할 수있는 능력 (단일 근육 섬유의 수축을 측정 할 때 초구조적 손상과 myofibrils의 정렬 불량에 기여할 수 있음)(그림 1D); 3) 근시 (~1 μm, 도 2A)의작은 직경과 멤브레인의 부족은 사마페에 거의 즉각적인 칼슘 확산을 허용한다. 더욱이, 구조적 손상이 myofibrils에 존재하는 경우에, 그(것)들은 확률이 그들의 격리 도중 또는 실험 도중 끊어질 것입니다. 따라서, myofibril 수축을 평가하는 것은 근육 수축의 기본 기계장치를 공부하고 방해된 액틴-미신 상호 작용이 육종 단백질에 있는 돌연변이에 기인한 근육 질병의 주요 원인인지 이해하는 우아한 방법입니다.
이 프로토콜은 나노 뉴턴 해상도 (즉, Optiforce)와 캔틸레버 힘 프로브를 통합 근시 릴의 수축을 결정하기 위해 새로 개발 된 설정을 제공합니다. 이 힘 프로브는 간섭법의 원리를 기반으로 합니다. 간섭측정을 통해 비교적 딱딱한 캔틸레버를 사용할 수 있습니다. 이를 통해 칸틸레버의 편향이 거의 없는 힘을 측정하여 근시 브릴리브릴의 이소메트릭 수축에 접근할 수 있습니다. 프로브는 높은 신호 대 잡음 비율로, 인간 과목에서 그 를 포함하여 다른 근육 생검에서 격리 된 단일 근시릴에 의해 생성 되는 낮은 수동 및 활성 힘의 평가에 대 한 수 있습니다. 이 설정에 통합된 광학 캔틸레버 힘 프로브는 Fabry-Pérot 간섭계12를기반으로 합니다. 간섭계는 발효에 장착된 광섬유와 금코팅 캔틸레버 사이의 작은 변위를 감지합니다(그림3). 광섬유와 캔틸레버 사이의 간격을 파브리 페로 캐비티라고 합니다. Myofibrils는 두 개의 접착제 코팅 유리 장착 섬유를 사용하여 프로브와 압착 모터 사이에 장착됩니다. 근시브릴에 의해 생성된 힘은 간섭계 데이터로부터 수학적으로 도출될 수 있다. 간섭측정은 두 개 이상의 파도의 중첩 또는 간섭을 기반으로 합니다(이 설정에서 세 개의 광파). 1,528.77-1,563.85 nm 사이의 파장을 가진 레이저 광은 간섭계에서 방출되고 광섬유를 통해 전송됩니다. 프로브에서 광섬유와 배지 사이의 인터페이스에서 빛이 1) 반사된다(도3A); 2) 매체와 캔틸레버의 인터페이스에서(도 3B); 및 3) 캔틸레버의 금속과 금 코팅 사이의 인터페이스에서(도 3C). 인터페이스 A 및 B의 반사는 프로브가 침수되는 매체의 굴절률(n)에 의존한다.n 세 개의 중첩 된 반사로 구성된 빛은 간섭계의 포토다이오드로 돌아갑니다. 포토다이오드는 빛의 강도를 측정하며, 이는 세 개의 중첩된 반사의 간섭 패턴의 결과입니다. 근시릴을 활성화하거나 스트레칭하여 수축력이 생성되면 근시릴이 캔틸레버를 끌어당깁니다. 이 움직임은 캐비티크기(d)를 변경하고 결과적으로 캐비티에 맞는 파장의 수를 변경합니다. 캔틸레버에 반사되는 빛은 다른 위상을 가지며, 그 결과 다른 간섭 패턴이 생성됩니다. 포토디오드는 볼트의 변화로 간섭 패턴 강도의 변화를 기록합니다. 그 후, myofibril 힘 생성은 이 변경에서 계산됩니다, 고려 캔틸레버 강성을 고려. 포스 프로브는 제조업체에 의해 보정되며, 캔틸레버의 자유 전달 끝에 부착된 마운팅 바늘의 끝을 밀어내고, 계량 스케일에 대해, 캔틸레버의 굽힘은 레아웃레이저(13)의파장의 배수와 동일하게 유지한다. 따라서 간섭법은 거리의 작은 변화를 감지하여 나노 뉴턴 분해능으로 힘을 측정할 수 있는 매우 민감한 방법입니다. 이 해상도를 통해 높은 신호 대 잡음 비율로 myofibrillar 힘 생산을 평가할 수 있습니다. 기존의 간섭 측정은 간섭 곡선의 선형 부분으로 측정 범위를 제한하지만, 레이저 파장의 잠금 증폭기 및 변조를 사용하여 이한계(14)를극복한다. 이 내용은 토론 섹션에서 보다 자세히 설명되어 있습니다.
myofibril 활성 장력을 측정하기 위해, 빠른 단계 관혈 시스템이 통합되어 myofibril을 칼슘 용액(그림4A)에노출시켰다. 빠른 단계 관류 시스템을 통해 10ms 이내에 솔루션 변경이 가능합니다. 직경이 작기 때문에 근비릴로 칼슘 확산이 거의 즉각적입니다. 따라서, 이 시스템은 활성화 및 휴식 중에 방출하는 동안 액틴-미오신 결합의 비율을 측정하는 데 특히 적합하다. 활성화(kACT)및 이완(kREL)의속도는 활성화-이완 곡선으로부터 결정될 수 있다. 또한, 농도가 증가하는 칼슘 용액에 myofibrils를 노출시킴으로써, 힘-칼슘 관계 및 칼슘 민감성을 결정할 수 있다.
또한, 압전 길이 모터는 myofibril의 빠른 스트레칭과 단축을 가능하게합니다. 이는 근시의 점탄성 특성(즉, 수동장력)을 연구할 수 있을 뿐만 아니라, 미오피브릴의 급속한 단축 및 재스트레칭을 수행하여 장력 재개발(kTR)의속도를 결정할 수 있는 가능성을 제공한다. 활성 및 수동 장력 실험모두에서 회수된 파라미터는 육종 단백질의 유전자 돌연변이에 의해 변경될 수 있다.
이 맞춤형 설정은 건강한 인간, 환자 및 마우스 골격 근육으로부터 분리된 myofibrils의 활성 및 수동 수축 특성을 측정하는 데 사용되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명된 것은 인간 또는 동물 골격 근 조직으로부터 분리된 myofibrils의 수축 기능을 평가하는 프로토콜입니다. 이 설정의 힘 해상도는 Chavan 외12에의해 이전에 설명되었습니다. 요컨대, 검출 섬유와 캔틸레버 사이에 형성된 파브리-페로 캐비티의 길이의 임의변동에 의해 결정되며, 이는 판독값(V로 발현됨)의 출력에서 소음의 지배적인 부분을 생성하며, 편향 감도(m/V로 표현)와 캔?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 AFM-텔레톤과 네말린 근종 요법을위한 재단 건물 강도에 의해 지원되었다. 저자는 이 기사에서 언급 된 제품의 제작자를 인정하고자합니다, IONOptix Inc.
Materials
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
Referencias
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).
- Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
- Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
- Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
- de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
- Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
- Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
- Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
- Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
- Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
- van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
- Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
- Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
- Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
- Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
- Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
- Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).
