Ontrafeling van de rol van discrete gebieden van het rattenbrein in de regulatie van ovulatie door omkeerbare inactivatie door tetrodotoxine micro-injecteringen
Summary
Dit protocol beschrijft de constructie van een goedkoop micro-injecttiesysteem, de stereotaxische implantatie in diepe hersenstructuren en de procedure voor getimede micro-injecties van tetrodotoxine bij wakkere en ongeremde ratten. Het doel is om de deelname van hypothalamische structuren aan de regulatie van de ovulatie te onthullen door hun neurale activiteit te remmen.
Abstract
Veel experimentele benaderingen zijn gebruikt voor het bestuderen van de rol van de hersenen in de regulatie van de ovulatie. Voorbeelden zijn de laesie en deafferentatie van neuronale groepen, beide invasieve methoden die de integriteit van het doelgebied permanent aantasten. Deze methoden gaan gepaard met neveneffecten die van invloed kunnen zijn op de analyse van acute en temporele regulerende mechanismen. De stereotaxische implantatie van geleide canules gericht op specifieke hersengebieden, gevolgd door een herstelperiode, stelt onderzoekers in staat om verschillende geneesmiddelen te micro-injecteren na het verdwijnen van de ongewenste effecten van de operatie. Tetrodotoxine is gebruikt om de rollen van verschillende hersengebieden in diverse fysiologische processen te bepalen, omdat het tijdelijk de natriumafhankelijke actiepotentiaal remt, waardoor alle neurale activiteit in het doelgebied wordt geblokkeerd. Dit protocol combineert deze methode met strategieën voor de beoordeling van de oestruscyclus en ovulatie om de rol van discrete hersengebieden in de regulatie van de ovulatie op bepaalde tijdstippen van een bepaald stadium van de oestruscyclus te onthullen. Wakkere en ongeremde ratten (Rattus norvegicus) werden gebruikt om de blokkerende effecten te vermijden die anesthetica en stresshormonen uitoefenen op de ovulatie. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere soorten, hersendoelen en farmacologische middelen om verschillende fysiologische processen te bestuderen. Toekomstige verbeteringen aan deze methode omvatten het ontwerp van een micro-injectiesysteem met glazen haarvaten met een kleine diameter in plaats van geleideules. Dit vermindert de hoeveelheid weefsel die tijdens de implantatie wordt beschadigd en vermindert de verspreiding van de geïnfundeerde geneesmiddelen buiten het doelgebied.
Introduction
Ovulatie is het proces waarbij een of meer volwassen eicellen eenmaal per oestrale / menstruatiecyclus uit de eierstokken worden vrijgegeven. Omdat alle zoogdiersoorten afhankelijk zijn van de productie van gameten om te broeden, heeft het begrip van de mechanismen die de ovulatie reguleren een enorme impact op gebieden variërend van biogeneeskunde, de vee-industrie en het onderhoud van bedreigde soorten. Ovulatie wordt gereguleerd door de hypothalamus-hypofyse-ovariële as, die verschillende hypothalamische en extra-hypothalamische gebieden omvat, de gonadotropen in de voorste hypofyse en de theca- en granulosacellen die, samen met de eicellen, de ovariële follikels in de eierstokken vormen1.
Ovariële follikels groeien, ontwikkelen en ovuleren uiteindelijk als reactie op de tonische en fasische secretie van het follikelstimulerend hormoon en het luteïniserend hormoon, de twee gonadotrofinen die door de gonadotropen worden uitgescheiden. Het patroon van gonadotrofinesecretie is cruciaal voor een goede folliculaire ontwikkeling en ovulatie en wordt gereguleerd door het gonadotrofine-releasing hormoon (GnRH)1,2. Dit neuropeptide wordt gesynthetiseerd door neuronen verspreid over het basale diencephalon en vervolgens uitgescheiden naar de portal vasculatuur die de hypothalamus en de voorste hypofyse verbindt. De secretoire activiteit van de GnRH-neuronen wordt op zijn beurt gemoduleerd door synaptische input die voortkomt uit verschillende hersenstructuren. Deze structuren geven informatie over de toestand van de externe en interne omgeving van het organisme, inclusief de beschikbaarheid van voedsel, de lengte van de fotoperiode en de concentratie van hormonen in het bloed. In die zin vormen ze het voortplantingspatroon van elke soort en moeten de specifieke rollen van dergelijke structuren worden bepaald om de mechanismen voor ovulatie goed te begrijpen. Als voorbeeld is aangetoond dat de fluctuatie in oestradiolniveaus tijdens de oestruscyclus de secretie van GnRH reguleert; GnRH-neuronen drukken echter niet de oestradiolreceptorisovorm uit die nodig is om dergelijke veranderingen te detecteren. Twee populaties van neuronen die deze receptoren tot expressie brengen, bevinden zich respectievelijk in het rostrale periventriculaire gebied van de derde ventrikel en in de boogvormige kern, en stellen synapsen vast met GnRH-neuronen. Er zijn aanwijzingen dat deze neuronen de concentratie van oestradiol interpreteren en vervolgens de activiteit van GnRH-neuronen stimuleren door kisspeptine vrij te geven, een krachtige inductor van GnRH-secretie3.
Experimenten met thermische of chemische laesies, evenals mechanische deafferentatie, stelden onderzoekers in staat om de betrokkenheid van verschillende hersenstructuren bij de regulatie van ovulatie te bepalen4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Deze experimenten hebben echter het nadeel dat ze invasief en traumatisch zijn, waardoor enkele dagen herstel nodig zijn voordat de effecten van de behandeling worden geëvalueerd, waardoor de analyse van de acute effecten van de behandeling wordt belemmerd. Bovendien hebben ze permanent invloed op de beoogde gebieden en verstoren ze andere fysiologische processen op de lange termijn. Vanwege deze problemen worden de resultaten van deze experimenten meestal verduisterd door de homeostatische compensatiemechanismen in het lichaam van het dier en het extraheren van nauwkeurige informatie over de temporele regulerende dynamiek waarbij het gebied betrokken is, is nogal moeilijk.
De micro-injectie van geneesmiddelen die de activiteit van neuronen tijdelijk verstoren door middel van geleideules is een geschikt alternatief dat de hierboven genoemde nadelen overtreft. De canules kunnen door een stereotaxische operatie in elk hersengebied worden geplaatst, waardoor de onderzoeker de medicamenteuze behandeling kan starten nadat de verstorende effecten van de operatie zijn verdwenen. De getimede micro-injectie van de medicijnen stelt onderzoekers in staat om hypothesen te testen met betrekking tot de bijdrage van de regio aan een bepaalde stap van het proces en kan worden uitgevoerd bij wakkere ingehouden of vrij bewegende dieren. Een verscheidenheid aan geneesmiddelen, waaronder lokale anesthetica, agonisten, antagonisten, inverse agonisten en biologische toxines zoals tetrodotoxine (TTX) kunnen op specifieke tijdstippen in het gebied van belang worden geïnjecteerd.
TTX is een biologisch toxine gesynthetiseerd door bacteriën die in het lichaam van de kogelvis leven, evenals andere gewervelde en ongewervelde dieren. TTX legt neurale activiteit stil door de selectieve en voorbijgaande blokkade van natriumkanalen, wat resulteert in de remming van natriumafhankelijke actiepotentiaalen. In aanwezigheid van TTX ervaren cellen een verandering in de depolarisatiefase en zijn dus niet prikkelbaar maar blijven ze in leven. Het blokkerende effect van TTX wordt verklaard door de moleculaire samenstelling: een guanidiniumgroep kan door het extracellulaire aspect van het natriumkanaal gaan, maar de rest van het molecuul kan niet passeren vanwege zijn grootte, dus het zit vast en blokkeert het kanaal13,14,15,16,17 . Het werkingsmechanisme van de TTX maakte het mogelijk om het te gebruiken als een hulpmiddel om het zenuwstelsel zowel in vitro als in vivo te bestuderen. Intracerebrale injectie van dit toxine is gebruikt om de rol van discrete hersengebieden in verschillende processen zoals geheugenretentie18, slaap en opwinding19, plaatsherkenning20, ruimtelijke navigatie21, drugsmisbruik22, thermoregulatie23, ontwikkeling van schizofrenie24, seksueel gedrag25 en regulatie van ovulatie26 onder andere. In dit protocol beschrijven we de effecten op de ovulatie van de voorbijgaande inactivatie van hypothalamische kernen door TTX micro-injectie bij wakkere en ongeremde ratten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft een methode om op elk moment een discreet gebied in de hersenen van wakkere en ongeremde ratten tijdelijk te inactiveren. Een eenvoudige methode om hun oestruscyclus te volgen en de ovulatie te beoordelen, wordt ook aangeboden. Dit protocol maakt een eenvoudige analyse mogelijk van de bijdrage van specifieke hersengebieden aan de mechanismen die de ovulatie aansturen door de ovulatoire uitkomst van met TTX behandelde dieren te vergelijken met die van met voertuigen behandelde dieren. Met uitzonderi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn Raymond Sanchez van de Universiteit van Washington dankbaar voor zijn waardevolle hulp bij het redigeren van manuscripten en M.Sc. Georgina Cortés en M.Sc. Cintia Javier voor hun technische ondersteuning bij de standaardisatie van deze techniek. We zijn ook dankbaar voor de leden van de dierenartsdiensten van Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández en MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán voor het uitstekende onderhoud en de verzorging van proefdieren. De experimenten beschreven in dit protocol werden ondersteund door DGAPA-PAPIIT subsidienummer: IN216015 en door CONACyT subsidienummer: 236908 roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva is een doctoraatsstudent van Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) en wordt ondersteund door de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Subsidienummer: 294555).
Materials
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
Referencias
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G., Conn, M., Freeman, E. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. , 107-133 (2000).
- Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
- Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
- Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
- Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
- Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
- Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
- Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
- Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
- Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
- Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
- Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
- Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
- Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
- Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
- Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
- Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
- Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
- Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
- Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
- Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
- Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , (2014).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
- Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
- Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
- Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
- Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
- James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
- Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
- Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
- Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Cunningham, M. G., O’Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
- Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
