Entschlüsselung der Rolle diskreter Bereiche des Rattengehirns bei der Regulation des Eisprungs durch reversible Inaktivierung durch Tetrodotoxin-Mikroinjektionen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines kostengünstigen Mikroinjektionssystems, seine stereotaktische Implantation in Tiefehirnstrukturen und das Verfahren zur zeitgesteuerten Mikroinjektion von Tetrodotoxin bei wachen und hemmungslosen Ratten. Ziel ist es, die Beteiligung hypothalamischer Strukturen an der Regulation des Eisprungs durch Hemmung ihrer neuronalen Aktivität aufzudecken.
Abstract
Viele experimentelle Ansätze wurden verwendet, um die Rolle des Gehirns bei der Regulation des Eisprungs zu untersuchen. Beispiele sind die Läsion und Taubferentation neuronaler Gruppen, beides invasive Methoden, die die Integrität des Zielbereichs dauerhaft beeinträchtigen. Diese Methoden gehen mit Kollateraleffekten einher, die die Analyse akuter und zeitlicher Regulationsmechanismen beeinflussen können. Die stereotaxische Implantation von Leitkanülen, die auf bestimmte Gehirnregionen abzielen, gefolgt von einer Erholungsphase, ermöglicht es den Forschern, verschiedene Medikamente nach dem Verschwinden der unerwünschten Auswirkungen der Operation zu mikroinjektieren. Tetrodotoxin wurde verwendet, um die Rolle mehrerer Hirnareale in verschiedenen physiologischen Prozessen zu bestimmen, da es vorübergehend die natriumabhängigen Aktionspotentiale hemmt und so alle neuronalen Aktivitäten in der Zielregion blockiert. Dieses Protokoll kombiniert diese Methode mit Strategien zur Beurteilung des Östrogenzyklus und des Eisprungs, um die Rolle diskreter Hirnregionen bei der Regulation des Eisprungs zu bestimmten Zeiten eines bestimmten Stadiums des Östrogenzyklus aufzudecken. Wache und hemmungslose Ratten (Rattus norvegicus) wurden verwendet, um die blockierenden Wirkungen zu vermeiden, die Anästhetika und Stresshormone auf den Eisprung ausüben. Dieses Protokoll kann leicht an andere Spezies, Gehirnziele und pharmakologische Wirkstoffe angepasst werden, um verschiedene physiologische Prozesse zu untersuchen. Zukünftige Verbesserungen dieser Methode umfassen das Design eines Mikroinjektionssystems, das Glaskapillaren mit kleinem Durchmesser anstelle von Führungskanülen verwendet. Dies reduziert die Menge an Gewebe, die während der Implantation beschädigt wird, und verringert die Ausbreitung der infundierten Medikamente außerhalb des Zielbereichs.
Introduction
Der Eisprung ist der Prozess, bei dem eine oder mehrere reife Eizellen einmal in jedem Estral- / Menstruationszyklus aus den Eierstöcken freigesetzt werden. Da alle Säugetierarten auf die Produktion von Gameten angewiesen sind, um sich zu vermehren, hat das Verständnis der Mechanismen, die den Eisprung regulieren, einen großen Einfluss auf Bereiche von der Biomedizin über die Viehwirtschaft bis hin zur Erhaltung gefährdeter Arten. Der Eisprung wird durch die Hypothalamus-Hypophysen-Ovarial-Achse reguliert, die mehrere hypothalamische und extrahypophthalamische Bereiche, die Gonadotrope in der vorderen Hypophyse und die Theka- und Granulosazellen umfasst, die zusammen mit den Eizellen die Eierstockfollikel in den Eierstöcken bilden1.
Eierstockfollikel wachsen, entwickeln und ovulieren schließlich als Reaktion auf die tonische und phasische Sekretion des follikelstimulierenden Hormons und des luteinisierenden Hormons, der beiden Gonadotropine, die von den Gonadotropen abgesondert werden. Das Muster der Gonadotropinsekretion ist entscheidend für die richtige Follikelentwicklung und den Eisprung und wird durch das Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH)1,2reguliert. Dieses Neuropeptid wird von Neuronen synthetisiert, die im gesamten basalen Zwischenhirn verstreut sind, und dann an das Portalgefäß abgesondert, das den Hypothalamus und die vordere Hypophyse verbindet. Die sekretorische Aktivität der GnRH-Neuronen wird wiederum durch synaptischen Input aus verschiedenen Gehirnstrukturen moduliert. Diese Strukturen vermitteln Informationen über den Zustand der äußeren und inneren Umgebung des Organismus, einschließlich der Verfügbarkeit von Nahrung, der Länge der Photoperiode und der Konzentration von Hormonen im Blut. In diesem Sinne prägen sie das Fortpflanzungsmuster jeder Art und die spezifischen Rollen solcher Strukturen müssen bestimmt werden, um die Mechanismen des Eisprungs richtig zu verstehen. Als Beispiel wurde gezeigt, dass die Schwankung des Östradiolspiegels während des Östrogenzyklus die Sekretion von GnRH reguliert; GnRH-Neuronen exprimiert jedoch nicht die Estradiolrezeptor-Isoform, die zum Nachweis solcher Veränderungen erforderlich ist. Zwei Populationen von Neuronen, die diese Rezeptoren exprimieren, befinden sich in der rostralen periventrikulären Region des dritten Ventrikels bzw. im Arkuatkern und stellen Synapsen mit GnRH-Neuronen her. Es gibt Hinweise darauf, dass diese Neuronen die Konzentration von Östradiol interpretieren und dann die Aktivität von GnRH-Neuronen stimulieren, indem sie Kisspeptin, einen starken Induktor der GnRH-Sekretion3,freisetzen.
Experimente mit thermischen oder chemischen Läsionen sowie mechanischer Taubferentation ermöglichten es den Forschern, die Beteiligung mehrerer Gehirnstrukturen an der Regulation des Eisprungs zu bestimmen4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Diese Experimente haben jedoch den Nachteil, dass sie invasiv und traumatisch sind und mehrere Tage der Genesung erfordern, bevor die Auswirkungen der Behandlung bewertet werden, was die Analyse der akuten Auswirkungen der Behandlung behindert. Zudem beeinflussen sie dauerhaft die Zielbereiche und stören langfristig andere physiologische Prozesse. Aufgrund dieser Probleme werden die Ergebnisse dieser Experimente in der Regel durch die homöostatischen Kompensationsmechanismen im Körper des Tieres verdeckt und es ist ziemlich schwierig, genaue Informationen über die zeitliche Regulationsdynamik zu extrahieren, an der der Bereich beteiligt ist.
Die Mikroinjektion von Medikamenten, die die Aktivität von Neuronen durch Leitkanülen vorübergehend stören, ist eine geeignete Alternative, die die oben genannten Nachteile übertrifft. Die Kanülen können durch eine stereotaxische Operation in jeder Gehirnregion platziert werden, so dass der Forscher die medikamentöse Behandlung beginnen kann, nachdem die verwirrenden Auswirkungen der Operation verschwunden sind. Die zeitgesteuerte Mikroinjektion der Medikamente ermöglicht es den Forschern, Hypothesen über den Beitrag der Region zu einem bestimmten Schritt des Prozesses zu testen und kann bei wachen, zurückhaltenden oder sich frei bewegenden Tieren durchgeführt werden. Eine Vielzahl von Medikamenten, darunter Lokalanästhetika, Agonisten, Antagonisten, inverse Agonisten und biologische Toxine wie Tetrodotoxin (TTX), können zu bestimmten Zeiten in die Region des Interesses mikroinjektiert werden.
TTX ist ein biologisches Toxin, das von Bakterien synthetisiert wird, die im Körper des Kugelfisches sowie anderer Wirbeltiere und Wirbellose leben. TTX stillt die neuronale Aktivität durch die selektive und transiente Blockade von Natriumkanälen, was zur Hemmung natriumabhängiger Aktionspotentiale führt. In Gegenwart von TTX erfahren Zellen eine Veränderung in der Depolarisationsphase und sind somit nicht erregbar, sondern bleiben am Leben. Die blockierende Wirkung von TTX erklärt sich durch seine molekulare Zusammensetzung: Eine Guanidiniumgruppe ist in der Lage, den extrazellulären Aspekt des Natriumkanals zu passieren, aber der Rest des Moleküls kann aufgrund seiner Größe nicht passieren, so dass es feststeckt und den Kanal13,14,15,16,17 blockiert . Der Wirkmechanismus des TTX ermöglichte seine Verwendung als Werkzeug zur Untersuchung des Nervensystems sowohl in vitro als auch in vivo. Die intrazerebrale Injektion dieses Toxins wurde verwendet, um die Rolle diskreter Hirnareale in verschiedenen Prozessen wie Gedächtnisretention18, Schlaf und Erregung19, Ortserkennung20, räumliche Navigation21,Drogenmissbrauch 22, Thermoregulation23, Entwicklung von Schizophrenie24, Sexualverhalten25 und Regulierung des Eisprungs26 zu untersuchen unter anderem. In diesem Protokoll beschreiben wir die Auswirkungen der vorübergehenden Inaktivierung von Hypothalamuskernen durch TTX-Mikroinjektion bei wachen und hemmungslosen Ratten auf den Eisprung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um eine diskrete Region im Gehirn von wachen und hemmungslosen Ratten zu einem bestimmten Zeitpunkt vorübergehend zu inaktivieren. Eine einfache Methode, um ihren Östrogenzyklus zu verfolgen und den Eisprung zu beurteilen, wird ebenfalls angeboten. Dieses Protokoll ermöglicht eine einfache Analyse des Beitrags bestimmter Gehirnregionen zu den Mechanismen, die den Eisprung antreiben, indem das Eisprungergebnis von TTX-behandelten Tieren mit dem von fahrzeugbehandelten Tieren verg…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Raymond Sanchez von der University of Washington für seine wertvolle Hilfe bei der Manuskriptbearbeitung und M.Sc. Georgina Cortés und M.Sc. Cintia Javier für ihre technische Unterstützung bei der Standardisierung dieser Technik. Wir danken auch den Mitgliedern der Veterinärdienste der Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández und MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán für die hervorragende Pflege und Pflege von Versuchstieren. Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden durch die DGAPA-PAPIIT-Zuschussnummer: IN216015 und durch die CONACyT-Zuschussnummer: 236908 an Roberto Domínguez unterstützt. Carlos-Camilo Silva ist Doktorand der Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) und wird vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Förderkennzeichen: 294555) unterstützt.
Materials
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
Referencias
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G., Conn, M., Freeman, E. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. , 107-133 (2000).
- Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
- Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
- Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
- Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
- Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
- Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
- Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
- Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
- Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
- Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
- Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
- Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
- Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
- Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
- Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
- Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
- Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
- Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
- Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
- Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
- Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , (2014).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
- Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
- Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
- Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
- Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
- James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
- Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
- Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
- Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Cunningham, M. G., O’Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
- Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
