Svelare il ruolo delle aree discrete del cervello del ratto nella regolazione dell'ovulazione attraverso l'inattivazione reversibile da microiniezioni di tetrodotossine
Summary
Questo protocollo descrive la costruzione di un sistema di microiniezione a basso costo, il suo impianto stereotassico in strutture cerebrali profonde e la procedura per microiniezioni tempori di tetrodotossina in ratti svegli e sfrenati. L’obiettivo è quello di rivelare la partecipazione delle strutture ipotalamiche nella regolazione dell’ovulazione inibendo la loro attività neurale.
Abstract
Molti approcci sperimentali sono stati utilizzati per studiare il ruolo del cervello nella regolazione dell’ovulazione. Gli esempi includono la lesione e la deafferentazione dei gruppi neuronali, che sono entrambi metodi invasivi che compromettono in modo permanente l’integrità dell’area target. Questi metodi sono accompagnati da effetti collaterali che possono influenzare l’analisi dei meccanismi di regolazione acuta e temporale. L’impianto stereotassico di cannule guida mirate a specifiche regioni del cervello, seguito da un periodo di recupero, consente ai ricercatori di microiniettare diversi farmaci dopo la scomparsa degli effetti indesiderati dell’intervento chirurgico. La tetrodotossina è stata utilizzata per determinare i ruoli di diverse aree cerebrali in diversi processi fisiologici perché inibisce transitoriamente i potenziali d’azione dipendenti dal sodio, bloccando così tutta l’attività neurale nella regione bersaglio. Questo protocollo combina questo metodo con strategie per la valutazione del ciclo estrale e dell’ovulazione per rivelare il ruolo delle regioni cerebrali discrete nella regolazione dell’ovulazione in particolari momenti di un dato stadio del ciclo estrale. Ratti svegli e sfrenati (Rattus norvegicus) sono stati utilizzati per evitare gli effetti bloccanti che gli anestetici e gli ormoni dello stress esercitano sull’ovulazione. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altre specie, bersagli cerebrali e agenti farmacologici per studiare diversi processi fisiologici. I miglioramenti futuri a questo metodo includono la progettazione di un sistema di microiniezione che utilizza capillari di vetro di piccolo diametro invece di cannule guida. Ciò ridurrà la quantità di tessuto danneggiato durante l’impianto e diminuirà la diffusione dei farmaci infusi al di fuori dell’area target.
Introduction
L’ovulazione è il processo attraverso il quale uno o più ovociti maturi vengono rilasciati dalle ovaie una volta ogni ciclo estrale / mestruale. Poiché tutte le specie di mammiferi dipendono dalla produzione di gameti per riprodursi, la comprensione dei meccanismi che regolano l’ovulazione ha un enorme impatto in aree che vanno dalla biomedicina, all’industria del bestiame e al mantenimento delle specie in via di estinzione. L’ovulazione è regolata dall’asse ipotalamo-ipofisi-ovaio, che coinvolge diverse aree ipotalamiche ed extra-ipotalamiche, i gonadotropi nell’ipofisi anteriore e le cellule theca e granulosa che, insieme agli ovociti, formano i follicoli ovarici all’interno delle ovaie1.
I follicoli ovarici crescono, si sviluppano e infine ovulano in risposta alla secrezione tonica e fasica dell’ormone follicolo-stimolante e dell’ormone luteinizzante, le due gonadotropine secrete dai gonadotropi. Il modello di secrezione di gonadotropina è fondamentale per il corretto sviluppo follicolare e l’ovulazione ed è regolato dall’ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH)1,2. Questo neuropeptide viene sintetizzato da neuroni sparsi in tutto il diencefalo basale e poi secreto alla vascolarizzazione portale che collega l’ipotalamo e l’ipofisi anteriore. L’attività secretoria dei neuroni GnRH è a sua volta modulata dall’input sinaptico derivante da diverse strutture cerebrali. Queste strutture trasmettono informazioni sullo stato dell’ambiente esterno e interno dell’organismo, compresa la disponibilità di cibo, la lunghezza del fotoperiodo e la concentrazione di ormoni nel sangue. In questo senso, modellano il modello riproduttivo di ciascuna specie e i ruoli specifici di tali strutture devono essere determinati al fine di comprendere correttamente i meccanismi che regolano l’ovulazione. Ad esempio, è stato dimostrato che la fluttuazione dei livelli di estradiolo durante il ciclo estrale regola la secrezione di GnRH; tuttavia, i neuroni GnRH non esprimono l’isoforma del recettore dell’estradiolo necessaria per rilevare tali cambiamenti. Due popolazioni di neuroni che esprimono questi recettori si trovano nella regione periventricolare rostrale del terzo ventricolo e nel nucleo arcuato, rispettivamente, e nelle sinapsi stabulanti con neuroni GnRH. Ci sono prove che suggeriscono che questi neuroni interpretano la concentrazione di estradiolo e quindi stimolano l’attività dei neuroni GnRH rilasciando kisspeptina, un potente induttore della secrezione di GnRH3.
Esperimenti che coinvolgono lesioni termiche o chimiche, così come la deafferentazione meccanica, hanno permesso ai ricercatori di determinare il coinvolgimento di diverse strutture cerebrali nella regolazione dell’ovulazione4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Questi esperimenti, tuttavia, hanno lo svantaggio di essere invasivi e traumatici, richiedendo diversi giorni di recupero prima di valutare gli effetti del trattamento, ostacolando l’analisi degli effetti acuti del trattamento. Inoltre, influenzano in modo permanente le aree mirate e interrompono altri processi fisiologici a lungo termine. A causa di questi problemi, i risultati di questi esperimenti sono solitamente oscurati dai meccanismi compensativi omeostatici nel corpo dell’animale ed estrarre informazioni accurate sulle dinamiche regolatorie temporali in cui l’area è coinvolta è piuttosto difficile.
La microiniezione di farmaci che interrompono transitoriamente l’attività dei neuroni attraverso cannule guida è un’alternativa adatta che supera gli svantaggi sopra menzionati. Le cannule possono essere posizionate in qualsiasi regione del cervello da un intervento chirurgico stereotassico, consentendo al ricercatore di iniziare il trattamento farmacologico dopo che gli effetti confondenti dell’intervento chirurgico scompaiono. La microiniezione temportica dei farmaci consente ai ricercatori di testare ipotesi riguardanti il contributo della regione a una particolare fase del processo e può essere eseguita in animali svegli trattenuti o in movimento libero. Una varietà di farmaci tra cui anestetici locali, agonisti, antagonisti, agonisti inversi e tossine biologiche come la tetrodotossina (TTX) possono essere microiniettati nella regione di interesse in momenti specifici.
TTX è una tossina biologica sintetizzata da batteri che vivono nel corpo del pesce palla e di altri vertebrati e invertebrati. TTX silenzia l’attività neurale attraverso il blocco selettivo e transitorio dei canali del sodio, che si traduce nell’inibizione dei potenziali d’azione dipendenti dal sodio. In presenza di TTX, le cellule sperimentano un’alterazione nella fase di depolarizzazione e quindi non sono eccitabili ma rimangono vive. L’effetto bloccante del TTX è spiegato dalla sua composizione molecolare: un gruppo guanidinio è in grado di passare attraverso l’aspetto extracellulare del canale del sodio, ma il resto della molecola non può passare a causa delle sue dimensioni, quindi è bloccato e blocca il canale13,14,15,16,17 . Il meccanismo d’azione del TTX ne ha permesso l’utilizzo come strumento per studiare il sistema nervoso sia in vitro che in vivo. L’iniezione intracerebrale di questa tossina è stata utilizzata per studiare il ruolo delle aree cerebrali discrete in diversi processi come la ritenzione della memoria18, sonno ed eccitazione19, il riconoscimento del luogo20, la navigazione spaziale21, l’abuso di droghe22, la termoregolazione23, lo sviluppo della schizofrenia24, il comportamento sessuale25 e la regolazione dell’ovulazione26 tra gli altri. In questo protocollo descriviamo gli effetti sull’ovulazione dell’inattivazione transitoria dei nuclei ipotalamici mediante microiniezione TTX in ratti svegli e sfrenati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive un metodo per inattivare transitoriamente, in qualsiasi momento, una regione discreta nel cervello di ratti svegli e sfrenati. Viene inoltre fornito un metodo semplice per monitorare il loro ciclo estrale e valutare l’ovulazione. Questo protocollo consente un’analisi diretta del contributo di specifiche regioni del cervello ai meccanismi che guidano l’ovulazione confrontando l’esito ovulatorio degli animali trattati con TTX con quello di quelli trattati con veicoli. Ad eccezione dello strumento s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Raymond Sanchez dell’Università di Washington per il suo prezioso aiuto nella redazione di manoscritti e a M.Sc. Georgina Cortés e M.Sc. Cintia Javier per il loro supporto tecnico nella standardizzazione di questa tecnica. Siamo anche grati ai membri dei servizi veterinari della Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández e MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán per l’eccellente manutenzione e cura degli animali da esperimento. Gli esperimenti descritti in questo protocollo sono stati supportati dal numero di sovvenzione DGAPA-PAPIIT: IN216015 e dal numero di sovvenzione CONACyT: 236908 a Roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva è uno studente di dottorato del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) ed è sostenuto dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Numero di sovvenzione: 294555).
Materials
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
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