Разгадка роли дискретных областей мозга крыс в регуляции овуляции посредством обратимой инактивации микроинъекциями тетродотоксина
Summary
Этот протокол описывает построение недорогой системы микроинъекций, ее стереотаксическую имплантацию в глубокие мозговые структуры и процедуру временных микроинъекций тетродотоксина у бодрствующих и несдержанных крыс. Цель – выявить участие гипоталамиковых структур в регуляции овуляции путем угнетения их нервной активности.
Abstract
Многие экспериментальные подходы были использованы для изучения роли мозга в регуляции овуляции. Примеры включают поражение и глухоту групп нейронов, которые являются инвазивными методами, которые постоянно ухудшают целостность целевой области. Эти методы сопровождаются побочными эффектами, которые могут повлиять на анализ острых и временных регуляторных механизмов. Стереотаксическая имплантация направляющих банюл, направленная на определенные области мозга, с последующим восстановительным периодом, позволяет исследователям микроинъектировать различные препараты после исчезновения нежелательных эффектов операции. Тетродотоксин был использован для определения роли нескольких областей мозга в различных физиологических процессах, поскольку он временно ингибирует натриезависимые потенциалы действия, тем самым блокируя всю нейронную активность в целевой области. Этот протокол сочетает этот метод со стратегиями оценки эстрального цикла и овуляции, чтобы выявить роль дискретных областей мозга в регуляции овуляции в определенные моменты любой заданной стадии эстрального цикла. Бодрствующие и несдержанные крысы(Rattus norvegicus)использовались, чтобы избежать блокирующих эффектов, которые анестетики и гормоны стресса оказывают на овуляцию. Этот протокол может быть легко адаптирован к другим видам, мишеням мозга и фармакологическим агентам для изучения различных физиологических процессов. Будущие усовершенствования этого метода включают в себя проектирование системы микроинъекции с использованием стеклянных капилляров малого диаметра вместо направляющих канюль. Это уменьшит количество ткани, поврежденной во время имплантации, и уменьшит распространение инфузии лекарств за пределы целевой области.
Introduction
Овуляция – это процесс, при котором один или несколько зрелых ооцитов высвобождаются из яичников один раз в каждый эстральный / менструальный цикл. Поскольку все виды млекопитающих зависят от производства гамет для размножения, понимание механизмов, регулирующих овуляцию, оказывает огромное влияние в областях, начиная от биомедицины, животноводства и содержания исчезающих видов. Овуляция регулируется гипоталамико-гипофизарно-яичниковой осью, которая включает в себя несколько гипоталамиковых и экстрагипоталамиковых областей, гонадотропы в передней гипофизе и клетки теки и гранулезы, которые вместе с ооцитами образуют фолликулы яичников внутри яичников1.
Фолликулы яичников растут, развиваются и в конечном итоге овулируют в ответ на тонизирующую и фазовую секрецию фолликулостимулирующего гормона и лютеинизирующего гормона, двух гонадотропинов, секретируемых гонадотропами. Структура секреции гонадотропина имеет решающее значение для правильного развития фолликулов и овуляции и регулируется гонадотропин-рилизинг-гормоном (ГнРГ)1,2. Этот нейропептид синтезируется нейронами, разбросанными по всему базальному диэнцефалону, а затем секретируется в воротную сосудистую, которая связывает гипоталамус и передний гипофиз. Секреторная активность ГнРГ-нейронов, в свою очередь, модулируется синаптическим входом, возникающим из различных структур мозга. Эти структуры передают информацию о состоянии внешней и внутренней среды организма, включая доступность пищи, длину фотопериода и концентрацию гормонов в крови. В этом смысле они формируют репродуктивную модель каждого вида, и конкретные роли таких структур должны быть определены, чтобы правильно понять механизмы, управляющие овуляцией. В качестве примера было показано, что колебания уровня эстрадиола во время эстрального цикла регулируют секрецию ГнРГ; однако ГнРГ-нейроны не экспрессируют изоформу рецептора эстрадиола, необходимую для обнаружения таких изменений. Две популяции нейронов, экспрессирующих эти рецепторы, расположены в ростральной перивентрикулярной области третьего желудочка и в дугообразном ядре соответственно, и стаблируют синапсы с ГнРГ-нейронами. Есть данные, свидетельствующие о том, что эти нейроны интерпретируют концентрацию эстрадиола, а затем стимулируют активность ГнРГ-нейронов, высвобождая кисспептин, мощный индуктор секрецииГнРГ 3.
Эксперименты с участием термических или химических поражений, а также механической глухоты, позволили исследователям определить вовлечение нескольких структур мозга в регуляцию овуляции4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Эти эксперименты, однако, имеют недостаток в том, что они являются инвазивными и травматичными, требующими нескольких дней восстановления, прежде чем оценивать эффекты лечения, что препятствует анализу острых эффектов лечения. Кроме того, они постоянно воздействуют на целевые участки и нарушают другие физиологические процессы в долгосрочной перспективе. Из-за этих проблем результаты этих экспериментов обычно затемняются гомеостатическими компенсаторными механизмами в организме животного и извлечение точной информации о временной регуляторной динамике, в которой задействована область, довольно сложно.
Микроинъекция препаратов, которые временно нарушают активность нейронов через направляющие канюли, является подходящей альтернативой, которая превосходит недостатки, упомянутые выше. Канюли могут быть помещены в любую область мозга с помощью стереотаксической операции, что позволяет исследователю начать медикаментозное лечение после того, как смешанные эффекты операции исчезнут. Временная микроинъекция препаратов позволяет исследователям проверять гипотезы относительно вклада региона в ту или иную ступень процесса и может быть выполнена у бодрствующих сдерживающих или свободно движущихся животных. Различные препараты, включая местные анестетики, агонисты, антагонисты, обратные агонисты и биологические токсины, такие как тетродотоксин (TTX), могут быть микроинъецированы в интересующее вас время.
TTX является биологическим токсином, синтезируемым бактериями, живущими в организме рыбы фугу, а также других позвоночных и беспозвоночных. TTX подавляет нейронную активность посредством селективной и преходящей блокады натриевых каналов, что приводит к ингибированию натриезависимых потенциалов действия. В присутствии TTX клетки испытывают изменения в фазе деполяризации и, таким образом, не возбудимы, а остаются живыми. Блокирующий эффект TTX объясняется его молекулярным составом: группа гуанидиния способна проходить через внеклеточный аспект натриевого канала, но остальная часть молекулы не может пройти из-за своих размеров, поэтому она застревает и блокирует канал13,14,15,16,17 . Механизм действия ТТХ позволил использовать его в качестве инструмента для изучения нервной системы как in vitro, так и in vivo. Внутримозговая инъекция этого токсина была использована для изучения роли дискретных областей мозга в нескольких процессах, таких как сохранение памяти18,сон и возбуждение19,распознавание места20,пространственная навигация21,злоупотребление наркотиками22,терморегуляция23,развитие шизофрении24,сексуальное поведение25 и регуляция овуляции26 среди прочих. В этом протоколе описано влияние на овуляцию транзиторной инактивации гипоталамического ядра микроинъекцией TTX у бодрствующих и несдержанных крыс.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описывается метод временной инактивации в любой момент времени дискретной области в мозге бодрствующих и неограниченных крыс. Также предусмотрен простой метод отслеживания их эструционного цикла и оценки овуляции. Этот протокол позволяет провести простой анализ вклада…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Раймонду Санчесу из Вашингтонского университета за его ценную помощь в редактировании рукописей и M.Sc Джорджине Кортес и M.Sc Синтии Хавьер за их техническую поддержку в стандартизации этой техники. Мы также благодарны членам ветеринарных служб факультета высших исследований Сарагосы: MVZ. Адриана Альтамирано, MVZ. Роман Эрнандес и MVZ. Долорес-Элизабет Гусман за отличное содержание и уход за подопытными животными. Эксперименты, описанные в этом протоколе, были поддержаны номером гранта DGAPA-PAPIIT: IN216015 и номером гранта CONACyT: 236908 Роберто Домингесу. Карлос-Камило Сильва является докторантом Программы доктора в области биомедицины, Национального университета мексики (УНАМ) и поддерживается Советом национального совета по вопросам науки и технологии (номер гранта: 294555).
Materials
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
Referencias
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G., Conn, M., Freeman, E. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. , 107-133 (2000).
- Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
- Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
- Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
- Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
- Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
- Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
- Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
- Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
- Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
- Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
- Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
- Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
- Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
- Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
- Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
- Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
- Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
- Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
- Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
- Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
- Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , (2014).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
- Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
- Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
- Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
- Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
- James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
- Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
- Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
- Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Cunningham, M. G., O’Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
- Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
