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Bioingeniería

Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung

Published: December 04, 2020
doi:
10.3791/61671
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems,Tel-Aviv University

Summary

Die vorgestellte Methode beinhaltet das einachsige Dehnen von 3D-Weichhydrogelen, die in Silikonkautschuk eingebettet sind, während eine konfokale Live-Mikroskopie ermöglicht wird. Die Charakterisierung der externen und internen Hydrogelstämme sowie die Faserausrichtung werden demonstriert. Das entwickelte Gerät und Protokoll kann die Reaktion von Zellen auf verschiedene Belastungsregime beurteilen.

Abstract

Äußere Kräfte sind ein wichtiger Faktor bei der Bildung, Entwicklung und Erhaltung von Gewebe. Die Auswirkungen dieser Kräfte werden oft mit spezialisierten In-vitro-Dehnungsmethoden untersucht. Verschiedene verfügbare Systeme verwenden 2D-Substrat-basierte Keilrahmen, während die Zugänglichkeit von 3D-Techniken zum Belasten weicher Hydrogele eingeschränkter ist. Hier beschreiben wir eine Methode, die das äußere Dehnen von weichen Hydrogelen aus ihrem Umfang ermöglicht, wobei ein elastischer Silikonstreifen als Probenträger verwendet wird. Das in diesem Protokoll verwendete Stretching-System besteht aus 3D-gedruckten Teilen und kostengünstiger Elektronik, so dass es einfach und leicht in anderen Labors repliziert werden kann. Der experimentelle Prozess beginnt mit der Polymerisation dicker (>100 μm) weicher Fibrinhydrogele (Elastizitätsmodul von ~100 Pa) in einem Ausschnitt in der Mitte eines Silikonstreifens. Silikon-Gel-Konstrukte werden dann an der bedruckten Dehnvorrichtung befestigt und auf den konfokalen Mikroskopstand gelegt. Unter Live-Mikroskopie wird das Dehnungsgerät aktiviert und die Gele werden in verschiedenen Dehnungsgrößen abgebildet. Die Bildverarbeitung wird dann verwendet, um die resultierenden Gelverformungen zu quantifizieren und relativ homogeneDehnungen und Faserausrichtung über die gesamte 3D-Dicke des Gels (Z-Achse) zu demonstrieren. Zu den Vorteilen dieser Methode gehören die Fähigkeit, extrem weiche Hydrogele während der In-situ-Mikroskopie in 3D zu belasten, und die Freiheit, die Geometrie und Größe der Probe nach den Bedürfnissen des Benutzers zu manipulieren. Darüber hinaus kann diese Methode bei richtiger Anpassung verwendet werden, um andere Arten von Hydrogelen (z. B. Kollagen, Polyacrylamid oder Polyethylenglykol) zu dehnen und die Analyse der Reaktion von Zellen und Geweben auf äußere Kräfte unter biomimetischen 3D-Bedingungen zu ermöglichen.

Introduction

Die Reaktion des Gewebes auf mechanische Kräfte ist ein integraler Bestandteil einer Vielzahl biologischer Funktionen, einschließlich Genexpression1, Zelldifferenzierung2und Gewebeumbau3. Darüber hinaus können kraftinduzierte Veränderungen in der extrazellulären Matrix (ECM) wie Faserausrichtung und Verdichtung das Zellverhalten und die Gewebebildung beeinflussen4,5,6. Die faserige Netzstruktur des ECM hat faszinierende mechanische Eigenschaften, wie nichtlineare Elastizität, nicht-affine Verformung und plastische Verformungen7,8,9,10,11,12. Diese Eigenschaften beeinflussen, wie Zellen und ihre umgebende Mikroumgebung auf äußere mechanische Kräfte reagieren13,14. Zu verstehen, wie das ECM und Gewebe auf mechanische Kräfte reagieren, wird Fortschritte auf dem Gebiet des Tissue Engineering und bei der Entwicklung genauerer rechnerischer und theoretischer Modelle ermöglichen.

Die gebräuchlichsten Methoden zum mechanischen Dehnen von Proben haben sich auf zellbeladene 2D-Substrate konzentriert, um die Auswirkungen auf das Zellverhalten zu untersuchen. Dazu gehören beispielsweise das Aufbringen von Dehnungen auf Polydimethylsiloxan (PDMS)-Substrate und die Analyse von Zellreorrichtungswinkeln in Bezug auf die Streckrichtung15,16,17,18,19. Methoden, die die Reaktion von 3D-zelleingebetteten Hydrogelen auf externe Dehnungen untersuchen, eine Situation, die die Mikroumgebung des Gewebes genauer nachahmt, sind jedoch begrenzter. Fortschritte in Richtung 3D-Stretching-Methoden sind von besonderer Bedeutung, da sich Zellen auf 2D-Substraten im Vergleich zu 3D-Matrizen anders verhalten20. Zu diesen Verhaltensweisen gehören zelluläre Neuausrichtung, Proteinexpressionsniveaus und Migrationsmuster21,22,23.

Methoden und Geräte, die eine 3D-Probendehnung ermöglichen, umfassen sowohl kommerziell erhältliche24,25,26,27,28 als auch solche, die für die Laborforschung entwickelt wurden29. Diese Verfahren verwenden aufwähfstbare Silikonschläuche30,Mehrbrunnenkammern31,Klemmen26,32, Bioreaktoren11,33, Ausleger34,35,36und Magnete37,38. Einige Techniken erzeugen Dehnungen, die lokal 3D-Hydrogele verformen, zum Beispiel durch Ziehen von Nadeln von zwei einzelnen Punkten im Gel5,während andere eine Verformung des gesamten Volumens des Gels16ermöglichen. Darüber hinaus konzentrieren sich die meisten dieser Systeme auf die Analyse des Dehnungsfeldes in der X-Y-Ebene, mit begrenzten Informationen über das Dehnungsfeld in Z-Richtung. Darüber hinaus sind nur eine Handvoll dieser Geräte in der Lage, mikroskopische In-situ-Bildgebung zu ermöglichen. Die größte Herausforderung bei der in situ hochvergrößerenden Bildgebung (z. B. konfokales Mikroskop) ist der begrenzte Arbeitsabstand von einigen hundert Mikrometern von der Objektivlinse zur Probe. Geräte, die Live-Bildgebung während der Dehnung ermöglichen, opfern die Gleichmäßigkeit der Dehnung in der Z-Achseoder sind relativ komplex und in anderen Labors schwer zu reproduzieren39,40.

Dieser Ansatz zum Dehnen von 3D-Hydrogelen ermöglicht statische oder zyklische einachsige Belastungen während der konfokalen Live-Mikroskopie. Das Dehnungsgerät (als “Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS” bezeichnet) besteht aus 3D-gedruckten Teilen und kostengünstiger Hardware, was eine einfache Reproduktion in anderen Labors ermöglicht. An dem Gerät ist ein handelsübliches Silikonkautschuk mit einem geometrischen Ausschnitt in der Mitte befestigt. Hydrogel-Komponenten werden polymerisiert, um den Ausschnitt zu füllen. Während der Polymerisation haften biologische Hydrogele wie Fibrin oder Kollagen auf natürliche Weise an den Innenwänden des Ausschnitts. Mit dem SCyUS wird der Silikonstreifen unoxidal gedehnt und kontrollierte Stämme auf das eingebettete 3D-Hydrogel41übertragen.

Dieses System ermöglicht eine einzigartige Kombination von Funktionen und Vorteilen im Vergleich zu anderen bestehenden Methoden. Erstens ermöglicht das System das einachsige Dehnen dicker 3D-Weichhydrogele (>100 μm dick, <1 kPa Steifigkeit) aus ihrer Peripherie mit Z-homogenerVerformung im gesamten Hydrogel. Diese Hydrogele sind zu weich, um mit herkömmlichen Zugtechniken gegriffen und gedehnt zu werden. Zweitens kann das Stretching-Gerät leicht in anderen Labors repliziert werden, da der 3D-Druck für Forscher leicht verfügbar ist und die im Design verwendete Elektronik kostengünstig ist. Drittens, und vielleicht das attraktivste Merkmal, kann die Geometrie und die Größe des Ausschnitts im Silikonstreifen leicht manipuliert werden, was abstimmbare Dehnungsgradienten und Randbedingungen sowie die Verwendung einer Vielzahl von Probenvolumina bis auf wenige Mikroliter ermöglicht.

Das vorgestellte Protokoll besteht darin, Fibringel in ~ 2 mm Durchmesser Scheiben in 0,5 mm dicken Silikonkautschukstreifen zu formen, die durch einachsige Dehnung unter live konfokale Mikroskopie durchgeführt werden. Im Folgenden werden die experimentellen Verfahren zur Messung und Analyse der auf den geometrischen Ausschnitt einwirkenden Dehnungen, die im Hydrogel entwickelten inneren Dehnungen sowie die daraus resultierende Faserausrichtung nach verschiedenen Dehnungsmanipulationen ausführlich erläutert. Schließlich wird die Möglichkeit diskutiert, Zellen in das Hydrogel einzubetten und sie einer kontrollierten äußeren Dehnung auszusetzen.

Protocol

1. Lösungsvorbereitung (im Voraus durchzuführen) Fibrinogen-MarkierungHINWEIS: Der Markierungsschritt ist nur erforderlich, wenn die Analyse der Verformung des Fibringels gewünscht wird. Für zelluläre Experimente ist es möglich, ein unmarkiertes Gel zu verwenden. 38 μL 10 mg/ml Succinimidylester-Fluoreszenzfarbstoff (gelöst in DMSO) zu 1,5 ml 15 mg/ml Fibrinogenlösung (Molverhältnis 5:1) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einen Shaker legen. An…

Representative Results

Repräsentative Daten von statischen Dehnungen zunehmender Größenordnungen, die auf den Silikonstreifen mit einem 3D-Fibrinhydrogel aufgebracht werden, eingebettet mit 1 μm fluoreszierenden Perlen, sind in Abbildung 9 dargestellt. Die Analyse zeigt die Wirkung von Silikondehnung auf geometrische Veränderungen des Ausschnitts sowie die entwickelten Dehnungen innerhalb des Gels. Z-Stapelbilderdes gesamten Gels werden verwendet, um die Verformung des ursprünglichen kreisf…

Discussion

Die hier vorgestellte Methode und das Protokoll basieren weitgehend auf unserer früheren Studie von Roitblat Riba et al.41 Wir schließen hier die vollständigen Computer-Aided Design (CAD), Python- und Mikrocontroller-Codes des SCyUS-Geräts ein.

Zu den wesentlichen Vorteilen der vorgestellten Methode gegenüber bestehenden Ansätzen gehört die Möglichkeit, sehr weiche 3D-Hydrogele (Elastizitätsmodul von ~100 Pa) aus ihrem Umfang und unter konfokale Li…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Einige hier enthaltene Figuren wurden mit Genehmigung des Copyright Clearance Center angepasst: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Straining von 3D-Hydrogelen mit gleichmäßigen Z-Achsen-Dehnungen bei gleichzeitiger Ermöglichung von Live-Mikroskopie-Bildgebung, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

Materials

Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose) Biological Industries 01-052-1A Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5 Bar-Naor Ltd. BN72204-30 22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO Sigma-Aldrich Inc. D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Biological Industries 02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human) Omrix Biopharmaceuticals 3902 Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer N/A Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) Invitrogen F8820 Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber McMaster-Carr 3788T41 580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) GE Healthcare 17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39 National Institute of Health, Bethesda, MD Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) Arduino/Adafruit Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge Thermo Scientific 75002470
Parafilm Bemis PM-996
Primovert Light Microscope Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. 491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks) Dassault Systèmes N/A
SCyUS Code37 N/A N/A
Servomotor – TowerPro SG-5010 Adafruit 155
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030 For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates Corning 430167
Thrombin buffer N/A Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries 03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male) N/A N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope Carl Zeiss AG 2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) Carl Zeiss AG Release Version 14.0.0.0
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Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, S., Tchaicheeyan, O., Saias, E., Lesman, A. Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61671, doi:10.3791/61671 (2020).
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