라이브 현미경 이미징 에서 3D 하이드로겔의 제어 변형
Summary
제시된 방법은 실리콘 고무에 내장된 3D 소프트 하이드로겔의 단종 스트레칭을 포함하면서 살아있는 공초점 현미경 검사를 허용합니다. 섬유 정렬뿐만 아니라 외부 및 내부 하이드로겔 균주의 특성화가 입증된다. 개발된 장치 및 프로토콜은 다양한 변형 정권에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있다.
Abstract
외부 힘은 조직 형성, 발달 및 유지 보수에 중요한 요소입니다. 이러한 힘의 효과 종종 시험 관 스트레칭 방법을 전문 사용 하 여 공부. 다양한 사용 가능한 시스템은 2D 기판 기반 들것을 사용하는 반면, 3D 기술의 접근성은 부드러운 하이드로겔을 변형시키는 데 더 제한적입니다. 여기서는 탄성 실리콘 스트립을 샘플 캐리어로 사용하여 둘레에서 부드러운 하이드로겔의 외부 스트레칭을 허용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에 활용되는 스트레칭 시스템은 3D 인쇄 부품과 저비용 전자 장치로 구성되므로 다른 실험실에서 간단하고 쉽게 복제할 수 있습니다. 실험 공정은 실리콘 스트립의 중앙에 컷아웃에서 두꺼운(>100 μm) 소프트 피브린 하이드로겔(탄성 계수 ~100Pa)을 중합하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 실리콘 겔 구조는 인쇄 된 스트레칭 장치에 부착되고 공초점 현미경 단계에 배치됩니다. 살아있는 현미경 검사에서 스트레칭 장치가 활성화되고 겔은 다양한 스트레치 크기로 이미지됩니다. 영상 처리는 젤의 3D 두께(Z-축)에 걸쳐 상대적으로 균일한 균질균및 섬유 정렬을입증하여 생성된 겔 변형을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 방법의 장점은 시투 현미경 검사법에서 실행하는 동안 3D에서 매우 부드러운 하이드로겔을 변형시키는 능력과 사용자의 요구에 따라 샘플의 형상 및 크기를 조작 할 수있는 자유를 포함한다. 또한, 적절한 적응을 통해, 이 방법은 다른 유형의 하이드로겔(예를 들어, 콜라겐, 폴리아크릴라미드 또는 폴리에틸렌 글리콜)을 스트레칭하는 데 사용될 수 있으며, 더 많은 생체 모방 3D 조건 하에서 외부 력에 대한 세포 및 조직 반응의 분석을 허용할 수 있다.
Introduction
기계적 힘에 대한 조직 반응은 유전자 발현1,세포 분화2및 조직 리모델링3을포함하는 광범위한 생물학적 기능의 필수적인 부분이다. 더욱이, 섬유 정렬 및 밀도와 같은 세포외 매트릭스(ECM)의 강제 유도 된 변화는 세포 거동 및 조직형성에영향을 미칠 수 있습니다4,5,6. ECM의 섬유질 메쉬 구조는 비선형 탄성, 비미세 변형 및 플라스틱 변형7,8,9,10,11,12와같은 흥미로운 기계적 특성을 갖는다. 이러한 특성은 세포와 주변 미세 환경이 외부 기계적힘(13,14)에어떻게반응하는지에영향을 미칩니다. ECM과 조직이 기계적 힘에 어떻게 반응하는지 이해하면 조직 공학 분야와 보다 정확한 전산 및 이론적 모델 의 개발에서 진전을 이룰 수 있습니다.
기계적으로 샘플을 스트레칭하는 가장 일반적인 방법은 세포 거동에 미치는 영향을 탐구하기 위해 세포가 풍부한 2D 기판에 초점을 맞추고있다. 이들은 예를 들어, 폴리디메틸실록산(PDMS) 기판에 균주를 적용하고 스트레치방향(15,16,17,18,19)과관련하여 세포 배향 각도를 분석한다. 그러나, 외부 스트레치에 3D 세포 임베디드 하이드로겔의 반응을 조사하는 방법은 조직 미세 환경을 보다 밀접하게 모방하는 상황이더 제한적이다. 3D 스트레칭 방법을 향한 어드밴스는 세포가 3D행렬(20)과비교할 때 2D 기판에서 다르게 행동하기 때문에 특히 중요합니다. 이러한 거동은 세포 재조정, 단백질 발현 수준 및 이동패턴(21,22,23)을포함한다.
3D 샘플 스트레칭을허용하는 방법 및 장치는24, 25, 26,27,28 및 실험실 연구를 위해 개발된29개모두를 포함한다. 이들 방법은 분해성 실리콘튜브(30),다중웰 챔버31개,클램프26,32,생물반응기11,33,캔틸레버34,35,36,및 자석37,38을사용한다. 일부 기술은 젤5의두 단일 지점에서 바늘을 당겨서 3D 하이드로겔을 국소 변형시키는 스트레치를 생성하고, 다른 기술은겔(16)의전체 대량의 변형을 허용한다. 더욱이, 이러한 시스템의 대부분은 Z-방향의스트레인 필드에 대한 제한된 정보와 함께 X-Y 평면에서 스트레인 필드의 분석에 초점을 맞춥니다. 추가적으로, 이 장치의 소수만이 시투 화상 진찰에 있는 현미경을 할 수 있습니다. 시상 고배율 이미징(예: 공초점 현미경)의 주요 과제는 객관적인 렌즈에서 샘플까지 수백 미크론의 제한된 작업 거리입니다. 스트레치 중에 라이브 이미징을 허용하는 장치는 Z축에서 균주의 균일성을 희생하거나 상대적으로 복잡하고 다른 실험실에서 재현하기 어려운39,40.
스트레치 3D 하이드로겔에 대한 이 접근법은 살아있는 공초점 현미경 검사관 동안 정적 또는 주기적 원색 균주를 허용합니다. 스트레칭 장치(‘스마트 순환 동종 들것 – SCyUS’라고 함)는 3D 인쇄 부품과 저비용 하드웨어를 사용하여 제작되어 다른 실험실에서 쉽게 재현할 수 있습니다. 장치에 부착된 것은 중앙에 기하학적 컷아웃이 있는 시판되는 실리콘 고무입니다. 하이드로겔 성분은 컷아웃을 채우기 위해 중합된다. 중합 화 하는 동안, 생물 하이드로 겔, 피브린 또는 콜라겐 등, 자연스럽 게 컷 아웃의 내부 벽에 부착. SCyUS를 사용하여 실리콘 스트립은 단원하게 뻗어 임베디드 3D하이드로겔(41)으로제어된 균주를 이송한다.
이 시스템은 다른 기존 방법에 비해 기능과 장점의 독특한 조합을 할 수 있습니다. 첫째, 이 시스템은 하이드로겔 전체에 걸쳐 Z-균질변형과 함께 주변에서 두꺼운 3D 소프트 하이드로겔(>100 μm 두께, <1 kPa 강성)의 단방향 스트레칭을 허용합니다. 이러한 하이드로겔은 기존의 인장 기술에 의해 잡히고 뻗어 너무 부드럽습니다. 둘째, 3D 프린팅은 연구원이 쉽게 사용할 수 있고 설계에 사용되는 전자 장치가 저렴한 비용으로 사용되기 때문에 스트레치 장치는 다른 실험실에서 쉽게 복제 될 수 있습니다. 셋째, 아마도 가장 매력적인 기능, 실리콘 스트립에서 컷아웃의 형상 및 크기는 쉽게 조작할 수 있어, 튜닝 가능한 스트레인 그라데이션 및 경계 조건뿐만 아니라 다양한 샘플 볼륨을 몇 마이크로리터까지 사용할 수 있습니다.
제시된 프로토콜은 라이브 공초점 현미경 검사의 밑에 uniaxial 스트레치에 의해 진행된 0.5 mm 두께의 실리콘 고무 스트립에 있는 ~2mm 직경 디스크로 성형 피브린 젤로 이루어져 있습니다. 다음은 기하학적 컷아웃에 작용하는 균주를 측정하고 분석하기 위한 실험 절차, 하이드로겔에서 개발된 내부 균주, 다양한 스트레치 조작 후의 결과 섬유 정렬에 대해 자세히 설명합니다. 마지막으로, 하이드로겔에 세포를 포함하고 통제된 외부 스트레치에 노출시킬 가능성에 대해 논의된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 원에 제시된 방법 및 프로토콜은 주로 Roitblat Riba 외.41에 의한 이전 연구를 기반으로 하며, 여기에 SCyUS 장치의 전체 컴퓨터 지원 설계(CAD), 파이썬 및 마이크로 컨트롤러 코드를 포함합니다.
기존 접근법에 비해 제시된 방법의 주요 장점은 매우 부드러운 3D 하이드로겔(+100 Pa의 탄성 계수)을 둘레에서, 그리고 살아있는 공초점 이미징하에서 변?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
여기에 포함 된 일부 수치는 저작권 허가 센터의 허가에 의해 적응되었습니다 : 스프링어 자연, 생물 의학 공학의 연보. 라이브 현미경 이미징을 가능하게하면서 균일 한 z 축 균주를 가진 3D 하이드로겔을 긴장, A. Roitblat 리바, S. 나탄, A. 콜렐, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, 저작권© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
Materials
| Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20002 | |
| Cell Medium (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate |
| Cover Slip #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22×40 mm |
| DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-1A | |
| EVICEL Fibrin Sealant (Human) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL |
| Fibrinogen Buffer | N/A | Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2) | |
| Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) | Invitrogen | F8820 | Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide |
| High-Temperature Silicone Rubber | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain |
| HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
| HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
| ImageJ FIJI software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
| Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
| MicroVL 21R Centrifuge | Thermo Scientific | 75002470 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Primovert Light Microscope | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
| SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systèmes | N/A | |
| SCyUS Code37 | N/A | N/A | |
| Servomotor – TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | For 50 mL tubes |
| Sterile 10 cm non-culture plates | Corning | 430167 | |
| Thrombin buffer | N/A | Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0) | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
| USB Cable (Type B Male to Type A Male) | N/A | N/A | |
| Zeiss LSM 880 Confocal Microscope | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
| ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |
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