JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingeniería

ライブ顕微鏡イメージング下での3Dヒドロゲルの制御株

Published: December 04, 2020
doi:
10.3791/61671
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems,Tel-Aviv University

Summary

提示された方法は、ライブ共焦点顕微鏡を可能にしながら、シリコーンゴムに埋め込まれた3Dソフトヒドロゲルの単軸ストレッチを含む。繊維のアライメントと同様に、外部および内部ヒドロゲル株の特性評価が実証されている。開発された装置およびプロトコルはさまざまなひずみのレジームに対する細胞の応答を査定できる。

Abstract

外力は組織形成、発達、維持において重要な要素です。これらの力の効果は、多くの場合、特殊なin vitroストレッチ法を使用して研究されます。様々な利用可能なシステムは、ソフトハイドロゲルを歪める3D技術のアクセシビリティながら、2D基板ベースのストレッチャーを使用し、より制限されています。ここでは、サンプルキャリアとして弾性シリコーンストリップを用いて、その周囲から軟質ヒドロゲルの外部ストレッチを可能にする方法について説明する。このプロトコルで利用される伸張システムは3Dプリント部品と低コストのエレクトロニクスから構成され、他のラボで簡単かつ容易に複製できます。実験プロセスは、シリコーンストリップの中心での切り抜きに厚い(>100 μm)ソフトフィブリンヒドロゲル(約100 Paの弾性率)を重合することで始まります。シリコーンゲルの構造は、印刷された伸張装置に取り付けられ、共焦点顕微鏡の段階に置かれる。ライブ顕微鏡では、ストレッチデバイスが活性化され、ゲルは様々なストレッチマグニチュードで画像化されます。その後、画像処理を使用して得られたゲル変形を定量化し、ゲルの3D厚さ(Z軸)全体で比較的均質な歪みと繊維のアライメントを実証します。この方法の利点は、その場合の顕微鏡で実行しながら、3Dで非常に柔らかいヒドロゲルを歪める能力、およびユーザーのニーズに応じてサンプルの形状とサイズを操作する自由が含まれます。さらに、適切な適応により、この方法は、他のタイプのヒドロゲル(例えば、コラーゲン、ポリアクリルアミドまたはポリエチレングリコール)を伸ばすために使用することができ、よりバイオミメティックな3D条件下での外力に対する細胞および組織応答の分析を可能にすることができる。

Introduction

機械的な力に対する組織応答は、遺伝子発現1、細胞分化2、および組織改修3を含む幅広い生物学的機能の不可欠な部分である。また、繊維アライメントや高密度化などの細胞外マトリックス(ECM)における力誘発変化は、細胞の挙動および組織形成4、5、6に影響を及ぼす可能性がある。ECMの繊維状メッシュ構造は、非線形弾性、非アフィン変形、塑性変形7、8、9、10、11、12などの興味深い機械的特性を有する。これらの特性は、細胞とその周囲の微小環境が外部の機械的力13,14に応答する方法に影響を与える。ECMと組織が機械的な力にどのように反応するかを理解することで、組織工学の分野や、より正確な計算モデルと理論モデルの開発が進むのが可能になります。

サンプルを機械的に伸ばす最も一般的な方法は、細胞の挙動への影響を探るために細胞を含む2D基質に焦点を当てています。これらは、例えば、ポリジメチルシロキサン(PDMS)基質に株を適用し、ストレッチ方向15、16、17、18、19に関連して細胞の再配向角度を分析することを含む。しかし、外部ストレッチに対する3D細胞埋め込みヒドロゲルの反応を調べる方法は、組織微小環境をより密接に模倣する状況であり、より限定的である。3D行列20と比較して細胞が2D基質上で異なる動作をするため、3Dストレッチ法への進歩は特に重要である。これらの行動には、細胞の再調整、タンパク質発現レベル、および移行パターン21、22、23が含まれる。

3Dサンプルストレッチを可能にする方法とデバイスは、市販の24、25、26、27、28と実験室研究29のために開発されたものの両方を含む。これらの方法は、分解性シリコーンチューブ30、マルチウェルチャンバー31、クランプ26、32、バイオリアクター11、33、カンチレバー34、35、36、および磁石37、38を使用する。いくつかの技術は、ゲル5の2つの単一点から針を引っ張るなどして、3Dヒドロゲルを局所的に変形させるストレッチを生成し、他の技術はゲル16の大部分の全体の変形を可能にする。さらに、これらのシステムのほとんどは、Z方向の歪みフィールドに関する限られた情報で、X-Y平面のひずみ場の分析に焦点を当てています。さらに、これらのデバイスのほんの一握りは、その画像化において顕微鏡的に可能である。この場所での主な課題は、高倍率イメージング(例えば、共焦点顕微鏡)は、対物レンズから試料までの数百ミクロンの限られた作業距離です。ストレッチ中にライブイメージングを可能にするデバイスは、Z軸の歪みの均一性を犠牲にするか、または他の実験室39、40で再現することは比較的複雑で困難である。

3Dヒドロゲルを伸ばすためにこのアプローチは、ライブ共焦点顕微鏡の間に静的または周期的な単軸歪みを可能にする。伸張装置(「スマートサイクリック単軸ストレッチャー -SCyUS」と呼ばれる)は、3Dプリント部品と低コストのハードウェアを使用して構築され、他のラボで簡単に再現できます。装置に取り付けられているのは、その中心に幾何学的な切り抜きを有する市販のシリコーンゴムである。ヒドロゲル成分は、切り出しを充填するために重合される。重合の間、フィブリンまたはコラーゲンなどの生物学的ヒドロゲルは、切り抜きの内壁に自然に付着する。SCyUSを用いて、シリコーンストリップは単軸に伸ばされ、制御された株を埋め込まれた3Dヒドロゲル41に移す。

このシステムは他の既存の方法と比較して特徴および利点の独特な組合せを可能にする。まず、このシステムは、厚い3Dソフトヒドロゲル(厚さ>100 μm、<1 kPa剛性)の単軸ストレッチを周囲から可能にし、ハイドロゲル全体で Z-均質変形を行います。これらのヒドロゲルは柔らかすぎて、従来の引張技術でつかんで引き伸ばされる。第二に、3Dプリンティングは研究者が容易に利用でき、設計に使用されるエレクトロニクスは低コストであるため、ストレッチングデバイスは他のラボで容易に複製することができます。第三に、そしておそらく最も魅力的な特徴は、シリコーンストリップの切り抜きの幾何学およびサイズは容易に操作でき、調整可能なひずみの勾配および境界条件、そして、サンプルの様々な量の使用を可能にする、数マイクロリットルまで。

提示された議定書は、生共焦点顕微鏡下で単軸ストレッチによって進行された0.5mm厚いシリコーンゴムストリップの直径~2mmのディスクにフィブリンゲルを成形して構成する。以下では、幾何学的切り抜きに作用する株を測定および分析するための実験手順、ヒドロゲルで開発された内部株、ならびに種々のストレッチ操作後の繊維アライメントを得る実験手順について詳しく説明する。最後に、ヒドロゲルに細胞を埋め込み、制御された外部ストレッチに曝す可能性について議論する。

Protocol

1. 溶液準備(事前に実施) フィブリノーゲンラベリング注: ラベル付け手順は、フィブリンゲルの変形を解析する場合にのみ必要です。細胞実験のために、標識されていないゲルを使用することができる。 10 mg/mL スクシニミジルエステル蛍光色素(DMSOに溶解)の38 μLを、15 mg/mLフィブリノーゲン溶液(モル比5:1)を50mL遠心チューブに加え、室温で1時間シェーカーに置きます。その後…

Representative Results

3Dフィブリンヒドロゲルを運ぶシリコーンストリップに適用される大きさの増加の静的ストレッチからの代表的なデータは、1μmの蛍光ビーズで埋め込まれた、図9に示されている。この分析は、シリコンストレッチが切り抜きの幾何学的変化およびゲル内で発達した株に及ぼす影響を示しています。ゲル全体のZ-スタック画像を使用して、元の円形状の切り?…

Discussion

本明細書に提示される方法とプロトコルは、主にRoitblat Ribaらの以前の研究に基づいており、41 ここに SCyUS デバイスの完全なコンピュータ支援設計(CAD)、Pythonおよびマイクロコントローラコードが含まれています。

既存のアプローチよりも提示された方法の主な利点は、非常に柔らかい3Dヒドロゲル(〜100 Paの弾性率)をその円周から、 およびラ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ここに含まれるいくつかの数字は、著作権クリアランスセンターの許可によって適応されています: スプリンガーネイチャー, 生物医学工学年報.生きた顕微鏡イメージングを可能にしながら、均一なZ軸株で3Dヒドロゲルを緊張させ、A.ロイトブラット・リバ、S.ナタン、A.コレル、H.ラシュキン、O.チャイチェヤン、A.レスマン、著作権©(2019)。

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

Materials

Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose) Biological Industries 01-052-1A Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5 Bar-Naor Ltd. BN72204-30 22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO Sigma-Aldrich Inc. D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Biological Industries 02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human) Omrix Biopharmaceuticals 3902 Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer N/A Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) Invitrogen F8820 Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber McMaster-Carr 3788T41 580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) GE Healthcare 17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39 National Institute of Health, Bethesda, MD Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) Arduino/Adafruit Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge Thermo Scientific 75002470
Parafilm Bemis PM-996
Primovert Light Microscope Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. 491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks) Dassault Systèmes N/A
SCyUS Code37 N/A N/A
Servomotor – TowerPro SG-5010 Adafruit 155
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030 For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates Corning 430167
Thrombin buffer N/A Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries 03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male) N/A N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope Carl Zeiss AG 2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) Carl Zeiss AG Release Version 14.0.0.0
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816 (2015).
  2. Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cyclic strain drives assembly and differentiation of skeletal myocytes. Tissue Engineering Part A. 17, 2543-2550 (2011).
  3. Grodzinsky, A. J., Levenston, M. E., Jin, M., Frank, E. H. Cartilage Tissue Remodeling in Response to Mechanical Forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 691-713 (2000).
  4. Munster, S., et al. Strain history dependence of the nonlinear stress response of fibrin and collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, 12197-12202 (2013).
  5. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS ONE. 4, 5902 (2009).
  6. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 377-383 (2002).
  7. Natan, S., Koren, Y., Shelah, O., Goren, S., Lesman, A. . Molecular Biology of the Cell. 31 (14), 1474-1485 (2020).
  8. Ban, E., et al. Mechanisms of Plastic Deformation in Collagen Networks Induced by Cellular Forces. Biophysical Journal. 114 (2), 450-461 (2018).
  9. Kim, J., et al. Stress-induced plasticity of dynamic collagen networks. Nature Communications. 8, 842 (2017).
  10. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  11. Wen, Q., Basu, A., Janmey, P. A., Yodh, A. G. Non-affine deformations in polymer hydrogels. Soft Matter. 8, 8039-8049 (2012).
  12. Muiznieks, L. D., Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, 866-875 (2012).
  13. Brown, A. E. X., Litvinov, R. I., Discher, D. E., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Multiscale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 325, 741-744 (2009).
  14. Carroll, S. F., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Cyclic tensile strain can play a role in directing both intramembranous and endochondral ossification of mesenchymal stem cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 73 (2017).
  15. Livne, A., Bouchbinder, E., Geiger, B. Cell reorientation under cyclic stretching. Nature Communications. 5, 3938 (2014).
  16. Wang, L., et al. Patterning cellular alignment through stretching hydrogels with programmable strain gradients. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 15088-15097 (2015).
  17. Xu, G. K., Feng, X. Q., Gao, H. Orientations of Cells on Compliant Substrates under Biaxial Stretches: A Theoretical Study. Biophysical Journal. 114 (3), 701-710 (2017).
  18. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2013).
  19. Lu, J., et al. Cell orientation gradients on an inverse opal substrate. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (19), 10091-10095 (2015).
  20. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  21. Bono, N., et al. Unraveling the role of mechanical stimulation on smooth muscle cells: a comparative study between 2D and 3D models. Biotechnology and Bioengineering. 113, 2254-2263 (2016).
  22. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
  23. Riehl, B. D., Park, J. H., Kwon, I. K., Lim, J. Y. Mechanical stretching for tissue engineering: two-dimensional and three-dimensional constructs. Tissue Engineering Part B: Reviews. 18, 288-300 (2012).
  24. Flexcell. Linear Tissue Train Culture Plate. Flexcell. , (2019).
  25. Flexcell. Tissue Train. Flexcell. , (2019).
  26. CellScale. MCT6 Stretcher. CellScale. , (2019).
  27. STREX. STB-150. STREX. , (2019).
  28. STREX. Stretch Chambers. STREX. , (2019).
  29. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab on a Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  30. Weidenhamer, N. K., Tranquillo, R. T. Influence of cyclic mechanical stretch and tissue constraints on cellular and collagen alignment in fibroblast-derived cell sheets. Tissue Engineering Part C: Methods. 19, 386-395 (2013).
  31. Yung, Y. C., Vandenburgh, H., Mooney, D. J. Cellular strain assessment tool (CSAT): precision-controlled cyclic uniaxial tensile loading. Journal of Biomechanics. 42, 178-182 (2009).
  32. Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 115, 986-991 (2018).
  33. Heher, P., et al. A novel bioreactor for the generation of highly aligned 3D skeletal muscle-like constructs through orientation of fibrin via application of static strain. Acta Biomaterialia. 24, 251-265 (2015).
  34. Foolen, J., Deshpande, V. S., Kanters, F. M. W., Baaijens, F. P. T. The influence of matrix integrity on stress-fiber remodeling in 3D. Biomaterials. 33, 7508-7518 (2012).
  35. Walker, M., Godin, M., Pelling, A. E. A vacuum-actuated microtissue stretcher for long-term exposure to oscillatory strain within a 3D matrix. Biomedical Microdevices. 20, 43 (2018).
  36. Zhao, R. G., Boudou, T., Wang, W. G., Chen, C. S., Reich, D. H. Decoupling cell and matrix mechanics in engineered microtissues using magnetically actuated microcantilevers. Advanced Materials. 25, 1699-1705 (2013).
  37. Li, Y. H., et al. Magnetically actuated cell-laden micro-scale hydrogels for probing strain-induced cell responses in three dimensions. NPG Asia Materials. 8, 238 (2016).
  38. Li, Y. H., et al. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Scientific Reports. 6, 19550 (2016).
  39. Humphrey, J. D., et al. A theoretically-motivated biaxial tissue culture system with intravital microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 7, 323-334 (2008).
  40. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 107, 3335-3339 (2010).
  41. Roitblat Riba, A., et al. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  42. Gomez, D., Natan, S., Shokef, Y., Lesman, A. Mechanical interaction between cells facilitates molecular transport. Advanced Biosystems. 3 (12), 1900192 (2019).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open- source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  44. EPFL Switzerland. OrientationJ plug in. EPFL Switzerland. , (2019).
  45. Goren, S., Koren, Y., Xu, X., Lesman, A. Elastic anisotropy governs the decay of cell-induced displacements. Biophysical Journal. 118 (5), 1152-1164 (2019).
  46. Notbohm, J., Lesman, A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Quantifying cell-induced matrix deformation in three dimensions based on imaging matrix fibers. Integrative Biology. 7 (10), 1186-1195 (2015).
  47. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. Journal of Cell Biology. 205 (2), 155-162 (2014).
  48. Cha, C. Y., et al. Tailoring Hydrogel Adhesion to Polydimethylsiloxane Substrates Using Polysaccharide Glue. Angewandte Chemie International Edition. 52, 6949-6952 (2019).
  49. Wirthl, D., et al. Instant tough bonding of hydrogels for soft machines and electronics. Science Advances. 3, (2017).
  50. Juarez-Moreno, J. A., Avila-Ortega, A., Oliva, A. I., Aviles, F., Cauich-Rodriguez, J. V. Effect of wettability and surface roughness on the adhesion properties of collagen on PDMS films treated by capacitively coupled oxygen plasma. Applied Surface Science. 349, 763-773 (2015).
  51. Kim, H. T., Jeong, O. C. PDMS surface modification using atmospheric pressure plasma. Microelectronic Engineering. 88, 2281-2285 (2011).
  52. Prasad, B. R., et al. Controlling cellular activity by manipulating silicone surface roughness. Colloids and Surfaces. 78, 237-242 (2010).

Tags

Keywords: 3D HydrogelsLive Microscopy ImagingMechanical CuesBiomechanical ResponsesHydrogel GeometryCell ResponseExtracellular MatrixDisease ProgressionCancer TherapiesFibrin GelFibrinogenThrombinPBSStretching DeviceSilicone Strip
check_url/es/61671?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, S., Tchaicheeyan, O., Saias, E., Lesman, A. Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61671, doi:10.3791/61671 (2020).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image