PCR موتاجينيسيس، الاستنساخ، التعبير، بروتوكولات تنقية البروتين السريع وتبلور النوع البري وأشكال متحولة من التربتوفان سينتاس
Summary
هذه المادة يقدم سلسلة من الطرق المتتالية للتعبير وتنقية السالمونيلا تيفيموريوم التربتوفان synthase شركات هذا البروتوكول نظام سريع لتنقية مجمع البروتين في يوم واحد. الأساليب المغطاة هي تولد الدم الموجه من الموقع ، والتعبير البروتيني في الإشريكية القولونية، والكروماتوغرافيا تقارب ، كروماتوغرافيا الترشيح هلام ، وتبلور.
Abstract
الدراسات الهيكلية مع التربتوفان synthase (TS) مجمع bienzyme (α2β2 TS) من السالمونيلا تيفيموريوم وقد أجريت لفهم أفضل لآلية الحفاز، والسلوك الألوستيرون، وتفاصيل التحول الأنزيمي من الركيزة إلى المنتج في الإنزيمات التي تعتمد على حزب العمال التقدمي. في هذا العمل، سمح نظام تعبير جديد لإنتاج وحدة β α المعزولة والمعزولة بتنقية كميات عالية من الوحدات الفرعية النقية α2β2StTS مجمع من الوحدات الفرعية المعزولة في غضون يومين. تم التنقية عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب تليها انشقاق علامة تقارب، وهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم، وحجم استبعاد الكروماتوغرافيا (SEC). لفهم دور المخلفات الرئيسية في إنزيم β الموقع بشكل أفضل ، تم إجراء تولد مباشر للموقع في دراسات هيكلية سابقة. تم إنشاء بروتوكول آخر لتنقية النوع البري والمتحول α2β2 مجمعاتسانتTS. بروتوكول بسيط وسريع وفعال باستخدام تجزئة كبريتات الأمونيوم وSEC سمح لتنقية α2β2StTS المعقدة في يوم واحد. كلا بروتوكولات تنقية وصفها في هذا العمل لها مزايا كبيرة بالمقارنة مع البروتوكولات السابقة لتنقية نفس المجمع باستخدام PEG 8000 والحيوانات المنوية لبلورة α2β2StTS المعقدة على طول بروتوكول تنقية. تبلور نوع البرية وبعض أشكال متحولة يحدث في ظل ظروف مختلفة قليلا، وإضعاف تنقية بعض المسوخ باستخدام PEG 8000 والحيوانات المنوية. لإعداد بلورات مناسبة للدراسات البلورية بالأشعة السينية بذلت عدة جهود لتحسين التبلور وجودة الكريستالوالتبريد. وينبغي أن تكون الطرق المعروضة هنا قابلة للتطبيق عموما لتنقية الوحدات الفرعية synthase التربتوفان ونوع البرية ومتحولة α2β2 StTSالمجمعات.
Introduction
مجمع التربتوفان synthase (TS) bienzyme (α2β2)هو إنزيم الألوستيرون، تحفيز الخطوتين الأخيرتين في التمثيل الحيوي للأحماض الأمينية L-تريبتوفان في البكتيريا والنباتات والفطريات1،2،3. بكتيريا السالمونيلا المعوية سيروفار تيفيموريوم (سانت)يسبب عدوى حادة في الجهاز الهضمي في البشر والحيوانات الأخرى. وبما أن البشر والحيوانات الأعلى ليس لديهم TS (EC 4.2.1.20) ، فإن تثبيط S. تم استكشاف typhimurium α2β2 TS مجمع (α2β2سانتTS) كهدف المخدرات المحتملة لعلاج cryptosporidiosis والسل4, التناسلية والعينية العدوى5, واستخدام مبيدات الأعشاب المحتملة فيالزراعة 6. α-subunit يحفز الانقسام الالدولية من الاندول-3-الجلسرين-فوسفات (IGP) إلى جليسيرالدهيدي-3-فوسفات (GAP) والانول, من خلال تشكيل الاندولينين tautomer وسيطة وبعد ذلك الكربون الكربون السندات الانقسام لإنتاج GAP والاتول3,6. يحتوي الموقع β الحفاز على جزيء مساعد بيريدوكسال 5′-فوسفات (PLP) مرتبط β-Lys87 عبر قاعدة Schiff ، والذي يعمل كبالوعة إلكترون في سياق ردود الفعل في الإنزيم β-subunit3,7. يحفز الموقع β استبدال الهيدروكسيل الجانبي L-Serine بالاندول لإعطاء L-Tryptophan وجزيء الماء في رد فعل يعتمد على PLP. سانت TS بمثابة نموذج طويل الأمد للتحقيق في توجيه الركيزة والاتصال التوستروني داخل المجمعات متعددة الانزيمات2،3. الاتصال الالستيري ثنائي الاتجاه بين α β-subunits من TS ضروري لمزامنة الخطوات الحفازة ومنع إطلاق الندول أثناء توليف L-تريبتوفان3. لتوسيع هذا الجهد، قمنا بإعداد العديد من المسوخ (β-Gln114Ala، β-Lys167Thr، و β-Ser377Ala) عن طريق طفرة نقطة واحدة لاستخدامها في مزيد من الاستكشافات للعلاقة بين هيكل الإنزيم وآلية ووظيفة في الموقع الحفاز من سانتTS β subunit.
بدأت مجموعة البحث إديث دبليو مايلز البحث التفصيلي حول الآلية الحفازة α2β2StTS. وقد ركزت الدراسات المبكرة مع الأصلي Escherichia القولونية α2β2 TS المعقدة على تنقية وتوصيف وحدة α الفرعيةالمعزولة 8،9، معزولة β وحدة فرعية10،11 وإعادة تشكيل مجمع α2β2 TS من الوحدات الفرعية المعزولة12. تم تنقية من قبل هطول الأمطار كبريتات الأمونيوم، وغسيل الكلى عينة، DEAE-Sephadex الكروماتوغرافيا، غسيل الكلى، وجولة كروماتوغرافية ثانية على عمود DEAE-Sephadex12. في بروتوكول آخر ، تم تحسين تنقية نفس المجمع عن طريق تحميل lysate الخلية الموضحة على عمود DEAE-Sephadex تليها خطوة كروماتوغرافية على عمود سيفاروز 4B ، وهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم وغسيل الكلى13. كلا البروتوكولين تنقية تستمر لمدة 4-5 أيام. Escherichia القولونية α2β2 TS معقدة تبلورت ولكن بلورات لم تكن مناسبة للانعراج الأشعة السينية في ذلك الوقت.
في دراسة جديدة، تم تنقية أشكال نوع المؤتلف والبرية من S. تيفيموريوم α2β2 TS المعقدة وتبلور14،15. تم التعبير عن مركب αالمؤتلف 2β2StTS بشكل مفرط في سلالة الإشريكية القولونية CB149 التي تحمل ناقل التعبير pEBA-10. تم الإبلاغ عن التبلور الأولي وجمع بيانات حيود الأشعة السينية وتحليل α2β2مجمع سانتTS14. ومع ذلك، إبرة طويلة ورقيقة مثل α2β2بلوراتسانتTS ضعف الدراسات الهيكلية. في محاولة لجمع أفضل بيانات حيود الأشعة السينية، ووصف بروتوكول تنقية آخر لتنقية نوع البرية وأشكال متحولة من α2β2StTS مجمع15. تم إجراء تنقية مع هطول الأمطار الأولي باستخدام spermine و PEG 8000 في lysate الخلية الموضحة وإزالة عجل ضخمة كبيرة عن طريق الطرد المركزي. تم تخزين الكسر الفائق الذي يحتوي على كميات عالية من α2β2مجمع StTS لمدة 16-48 ساعة عند 4 درجات مئوية حتى عجلت بلورات صفراء. تم غسل البلورات و dialyzed على نطاق واسع ضد المخازن المؤقتة المختلفة. تم إعادة تبلور مجمع البروتين في العازلة التي تحتوي على كبريتات الأمونيوم و dialyzed15. على الرغم من أن تبلور البروتين يعتمد على البروتين وتركيزات متسرعة في الحل، فإنه من الصعب رصد والتنبؤ، وإعادة إنتاج تنقية لأشكال متحولة أخرى من α2β2StTS المعقدة في الحل. هذا البروتوكول له ميزة أنه لا يستخدم أي طرق كروماتوغرافية; ومع ذلك ، فإن المساوئ هي وقت التنقية الطويل اللازم لبلورة ، dialyze ، وإعادة التبلور ، وعادة ما تتطلب 5-7 أيام. للحصول على بلورات مناسبة لجمع بيانات الأشعة السينية، تم تقييم أكثر من 600 حالة تبلور باستخدام مزيج وتنوع تركيز البروتين ودرجة الحرارة والمهمات (PEG 4000 و6000 و8000)، والمواد المضافة (CaCl2، MnCl2، ZnCl2، الجثث ، الرسين ، الحيوانات المنوية ، أو spermidine)15. بلورات كان شكل بلوري أفضل ونمت بشكل أسرع في الظروف التي تحتوي على 12٪ PEG 8000 و 2 mM spermine. كان التبلور أكثر ملاءمة عند 25 درجة مئوية بدلا من 4 أو 30 أو 42 درجة مئوية ونما إلى أقصى أبعاد في غضون 3 أيام15. تم الإبلاغ عن عدة α2β2StTS الهياكل الكريستالية في ذلك الوقت (1996-1999)16،17،18،19،20،21 والعديد من الهياكل الأخرى قد نشرت حتى الآن.
هنا, الغرض الرئيسي هو تقديم بروتوكولات بديلة لتنقية synthase التربتوفان وتحسين تبلور البروتين. يظهر هذا العمل تحسينات كبيرة لتنقية النوع البري المعزول α الفرعي (αStTS) ، β الفرعي المعزول (βStTS) ، المعاد تشكيله α2β2مجمعStTS من الوحدات الفرعية المعزولة ، والنوع البري والأشكال المتحولة α2β2StTS complex. المزايا على البروتوكولات السابقة كبيرة منذ تم تخفيض وقت تنقية بشكل كبير وتبلور و cryoprotection تم الأمثل. وقد تبلورت أشكال متحولة من α2β2مجمع سانتTS المهندسة في هذا العمل بالقرب من نفس الشرط المستخدمة لشكل نوع البرية. ومع ذلك ، كان من الضروري تحسين التبلور الدقيق للحصول على بلورات واحدة كبيرة ذات جودة كافية لتحديد الهيكل بدقة ذرية قريبة. حتى الآن، هناك 134 هياكل الكريستال التربتوفان synthase المودعة في بنك بيانات البروتين (PDB)، والمحاسبة 101، 31 و 2 هياكل الكريستال، على التوالي، للبكتيريا، archaea و eukaryote. لطيف، 73 هياكل تنتمي إلى S. enterica سيروفار تيفيموريوم و 5 هياكل الكريستال من α2β2StTS المعقدة لديها حدود القرار أعلى من 1.50 Angstroms. ليس من المستغرب، تم إعداد 4 من أصل 5 في مجموعتنا البحثية (PDB IDs:5CGQ في 1.18 Å، 4HT3 في 1.30 Å، 4HPJ في 1.45 Å، 6DZ4 في 1.45 Å القرار). ومن المتوقع أن توفر الهياكل البلورية المكررة لشكل متحول من α2β2StTS المعقد رؤى جديدة في الآلية والأدوار التي تلعبها بقايا الأحماض الأمينية الأساسية المشاركة في توليف L-تريبتوفان.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد نجحنا في هندسة شكل متحول α2β2 βQ114A ، α2β2 βK167T ، وα 2β2 βS377A StTS لدراسات الارتباط بين الهيكل والوظيفة. في البداية ، حاولنا تنقية المسوخ باستخدام بروتوكول تنقية سابق22، والذي يتطلب α2β2 StTSتبلور معقد مع PEG 8000 والحيوانات المن?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للصحة في الولايات المتحدة (GM097569).
Materials
| 15 mL 10 kDa filter | MilliporeSigma | UFC901024 | centrifugal filter unit |
| 15 mL 100 kDa filter | MilliporeSigma | UFC910024 | centrifugal filter unit |
| 2 mL cryogenic vials | Corning | CLS430489 | Cryogenic vials |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-141 | microcentrifuge tubes |
| 24-well Cryschem Plate | Hampton Research | HR3-158 | 24-well sitting drop plates |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | Chemical |
| 50 mL centrifuge conical tubes | Thermo Scientific | 12-565-270 | centrifuge conical tubes |
| AB15 ACCUMET Basic | Fisher Scientific | 13-636-AB15 | pH meter |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | Agarose gel |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | Chemical |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | Antibiotic |
| Bacterial incubator | Fisher Scientific | S35836 | incubator. |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | Chemical |
| Branson 450 Digital Sonifier | Brason | B450 | Cell disruptor |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | BP210-100 | Chemical |
| Cesium hydroxide | Acros Organics | AC213601000 | Chemical |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | Antibiotic |
| dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D1391 | Chemical |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172-5 | Chemical |
| DNA Polymerase | Thermo Scientific | F530S | HF polymerase |
| dNTP Set | Invitrogen | 10-297-018 | dNTPs set |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | Restriction enzyme |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chemical |
| Excella E25R Orbital Shaker | Eppendorf New Brunswick | M1353-0004 | Orbital incubator |
| GE AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 8149-30-0004 | FPLC |
| Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | DNA purification kit |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Chemical |
| HindIII | New England Biolabs | R0104S | Restriction enzyme |
| His-Trap columns | GE Healthcare | GE17-5255-01 | 5 mL Histrap column |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | Chemical |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Inducer |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Antibiotic |
| Kelvinator Series-100 | Kelvinator | discontinued | Ultra low freezer |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Liquid broth |
| Luria Bertani agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Solid broth |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Chemical |
| NcoI | New England Biolabs | R0193S | Restriction enzyme |
| Ni-NTA affinity beads | Thermo Fisher Scientific | R90115 | Ni-NTA agarose beads |
| PEG 8000 | Fisher Scientific | BP233-100 | Chemical |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | 44-865-0 | Chemical |
| pyridoxal phosphate | Acros Organics | AC228170010 | Chemical |
| S-200 HR | Cytiva | 45-000-196 | Size exclusion column |
| SacI | New England Biolabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Chemical |
| Sorvall RC-5B centrifuge | Sorvall | 8327-30-1004 | Floor cetrifuge |
| Spermine | Acros Organics | AC132750010 | Chemical |
| Superdex 200 prep grade | Cytiva | 45-002-491 | Size exclusion column |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA liagse |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Chemical |
| Ubl-specific protease 1 | Thermo Scientific | 12588018 | SUMO Protease |
Referencias
- Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
- Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).
- Dunn, M. F. Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).
- Chaudhary, K., Roos, D. S. Protozoan genomics for drug discovery. Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).
- Caldwell, H. D., et al. Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates. Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).
- Kulik, V., et al. On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).
- Barends, T. R., et al. Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate. Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).
- Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).
- Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies. Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).
- Wilson, D. A., Crawford, I. P. Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase. Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).
- Adachi, O., Miles, E. W. A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield. Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).
- Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex. Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).
- Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments. Bioquímica. 18 (22), 4827-4835 (1979).
- Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).
- Miles, E. W., et al. The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230. Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).
- Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex. Bioquímica. 35 (13), 4211-4221 (1996).
- Rhee, S., et al. Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes. Bioquímica. 36 (25), 7664-7680 (1997).
- Schneider, T. R., et al. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase. Bioquímica. 37 (16), 5394-5406 (1998).
- Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49. Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).
- Weyand, M., Schlichting, I. Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate. Bioquímica. 38 (50), 16469-16480 (1999).
- Sachpatzidis, A., et al. Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase. Bioquímica. 38 (39), 12665-12674 (1999).
- Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382. Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Lowry, O. H., et al. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits. Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).
- Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, 271-281 (2011).
- Evans, P. Scaling and Assessment of Data Quality. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 72-82 (2006).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
- Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 22-25 (2010).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 213-221 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 486-501 (2010).
- Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, 240-255 (1997).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, 352-367 (2012).
- Matthews, B. W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).
- Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).
