PCR Mutagenesis, Clonagem, Expressão, Protocolos rápidos de purificação de proteínas e Cristalização do Tipo Selvagem e Formas Mutantes de Synthase Triptofano

Summary

Este artigo apresenta uma série de métodos consecutivos para a expressão e purificação de Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp este protocolo um sistema rápido para purificar o complexo proteico em um dia. Os métodos cobertos são mutagênese direcionada ao local, expressão proteica em Escherichia coli,cromatografia de afinidade, cromatografia de filtração de gel e cristalização.

Abstract

Estudos estruturais com complexo de sindtofano (TS) complexo de bienzyme (α₂β₂ TS) de Salmonella typhimurium foram realizados para entender melhor seu mecanismo catalítico, comportamento alolítico e detalhes da transformação enzimática do substrato ao produto em enzimas dependentes de PLP. Neste trabalho, um novo sistema de expressão para produzir o isolado α e isolado β-subunidade permitiu a purificação de altas quantidades de subunidades puras e α_{complexo de 2}β₂St.TS das subunidades isoladas dentro de 2 dias. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade seguida de decote da tag de afinidade, precipitação de sulfato de amônio e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Para melhor compreender o papel dos resíduos-chave na enzima β-local, a mutagênese direta do local foi realizada em estudos estruturais anteriores. Outro protocolo foi criado para purificar o tipo selvagem e mutante α₂β₂complexosde St.TS. Um protocolo simples, rápido e eficiente usando fracionamento de sulfato de amônio e SEC permitiu a purificação de α_{complexo de 2}β₂StTS em um único dia. Ambos os protocolos de purificação descritos neste trabalho têm vantagens consideráveis quando comparados com protocolos anteriores para purificar o mesmo complexo usando PEG 8000 e espermaina para cristalizar o complexo α₂β₂StTS ao longo do protocolo de purificação. Cristalização do tipo selvagem e algumas formas mutantes ocorre em condições ligeiramente diferentes, prejudicando a purificação de alguns mutantes usando PEG 8000 e espermaina. Para preparar cristais adequados para estudos cristalográficos de raios-X foram feitos diversos esforços para otimizar a cristalização, a qualidade do cristal e a crioproteção. Os métodos aqui apresentados devem ser geralmente aplicáveis para a purificação de subunidades de synthase triptofano e tipo selvagem e mutante α₂β₂complexosde St.TS.

Introduction

O complexo de xodó-sintéria triptofano (TS) (α₂β₂) é uma enzima alusicana, catalisando os dois últimos passos na biossíntese do aminoácido L-Triptofano em bactérias, plantas e fungos^1,2,3. A bactéria Salmonella enterica serovar typhimurium (St)causa uma grave infecção gastrointestinal em humanos e outros animais. Uma vez que os seres humanos e animais superiores não possuem TS (EC 4.2.1.20), a inibição de S. typhimurium α_{complexo 2}β₂ TS (α₂β₂StTS) tem sido explorado como um potencial alvo de drogas para o tratamento de criptosporidiose e tuberculose⁴, infecções genitais e oculares⁵, e para potencial utilização de herbicidas na agricultura⁶. O α-subunidade catalisa o decote aldolítico de indole-3-glicerol-fosfato (IGP) ao glicealdeído-3-fosfato (GAP) e indol, através da formação de um teima de ligação indolenina tautomer e, posteriormente, de ligação carbono-carbono para produzir GAP e indole^3,6. O sítio β-catallítico contém uma molécula de cofato piridoxal de 5′-fosfato (PLP) ligada a β-Lys87 através de uma base de Schiff, que funciona como um dissipador de elétrons no curso das reações na enzima β-subunidade^3,7. O β-local catalisa a substituição do hidroxyl de cadeia lateral L-Serine por indol para dar L-Triptofano e uma molécula de água em uma reação dependente de PLP. St. A TS serve como um modelo de longa data para a investigação de canalização de substratos e comunicação alotérica dentro de complexos multienzimáticos^2,3. A comunicação alotérica bidirecional entre as subunidades α e β de TS é necessária para sincronizar as etapas catalíticas e evitar a liberação de indol durante a síntese L-Triptophan³. Para estender esse esforço, preparamos vários mutantes (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr e β-Ser377Ala) por mutação de ponto único para ser usado em novas explorações da relação entre estrutura enzimática, mecanismo e função no local catalítico da subunidade stTS β.

Uma pesquisa detalhada sobre o mecanismo catalítico de α₂β₂StTS foi iniciada pelo grupo de pesquisa de Edith W. Miles. Estudos iniciais com o complexo escherichia coli nativo α₂β₂ TS têm focado na purificação e caracterização da subunidade isolada α^8,9, isolada β-subunidade^10,11 e a reconstituição do complexo α₂β₂ TS das subunidades isoladas¹². A purificação foi realizada por precipitação de sulfato de amônio, diálise amostral, cromatografia DEAE-Sephadex, diálise e uma segunda rodada cromatográfica na coluna DEAE-Sephadex¹². Em outro protocolo, a purificação do mesmo complexo foi melhorada carregando o lysato celular esclarecido em uma coluna DEAE-Sephadex seguida de um passo cromatográfico em uma coluna Sepharose 4B, precipitação de sulfato de amônio e diálise¹³. Ambos os protocolos de purificação duram de 4 a 5 dias. Escherichia coli α₂β complexo₂ TS cristalizado, mas os cristais não eram adequados para difração de raios-X na época.

Em um novo estudo, formas recombinantes e selvagens de S. typhimurium α_{complexo de 2}β₂ TS foram purificadas e cristalizadas^14,15. O complexo de α₂β₂StTS foi superexpresso na cepa E. coli CB149 carregando o vetor de expressão pEBA-10. Foram relatados¹⁴a coleta e análise inicial de dados de cristalização e difração de raios-X do complexo de α₂β₂StTS . No entanto, agulhas longas e finas como α₂β₂Cristaisde St.TS prejudicaram estudos estruturais. Na tentativa de coletar melhores dados de difração de raios-X, outro protocolo de purificação foi descrito para purificar o tipo selvagem e as formas mutantes do α₂β₂Complexo StTS¹⁵. A purificação foi realizada com uma precipitação inicial usando esperteza e PEG 8.000 no lysato celular esclarecido e um grande precipitado volumoso foi removido por centrifugação. A fração supernante contendo altas quantidades de α₂β complexoStTS_foiarmazenada por 16-48 h a 4 °C até que os cristais amarelos precipitados. Cristais foram lavados e extensivamente dialisados contra diferentes tampões. O complexo proteico foi recriminado em tampão contendo sulfato de amônio e dialisado¹⁵. Embora, a cristalização proteica dependa de concentrações de proteínas e precipitantes em solução, é difícil monitorar, prever e reproduzir a purificação para outras formas mutantes de α₂β complexode StTS₂em solução. Este protocolo tem a vantagem de não utilizar nenhum método cromatográfico; no entanto, as desvantagens são o longo tempo de purificação necessário para cristalizar, dialisar e recristallizar, normalmente exigindo de 5 a 7 dias. Para obter cristais adequados para coleta de dados de raios-X, mais de 600 condições de cristalização foram avaliadas utilizando-se uma combinação e variação de concentração proteica, temperatura, precipitantes (PEG 4.000, 6.000 e 8.000), e aditivos (CaCl₂, MnCl₂, ZnCl₂, cadáver, putrescina, espermióides ou espermióides)¹⁵. Os cristais tinham uma melhor forma cristalina e cresceram mais rápido em condições que continham 12% de PEG 8.000 e 2 mM de espermatozoides. A cristalização foi mais favorável a 25 °C em vez de 4, 30 ou 42 °C e cresceu para dimensões máximas em 3 dias¹⁵. Vários α₂β₂estruturas de cristalstSforam relatadas na época (1996-1999)^{16,17,18,19,20,21} e muitas outras estruturas foram publicadas até o momento.

Aqui, o objetivo principal é apresentar protocolos alternativos para purificar a sinthase triptofano e otimizar a cristalização proteica. O presente trabalho apresenta melhorias significativas para purificar o tipo selvagem isolado α-subunidade (αStTS), unidade isolada β-subunidade (βStTS), reconstituída α_{complexo de 2}β₂St.TS das subunidades isoladas, e tipo selvagem e formas mutantes do complexo α₂β₂St.TS. As vantagens em relação aos protocolos passados são consideráveis, uma vez que o tempo de purificação foi reduzido significativamente e a cristalização e a crioproteção foram otimizadas. Formas mutantes de α₂β complexostS₂projetado neste trabalho cristalizaram perto da mesma condição usada para a forma tipo selvagem. No entanto, a otimização da cristalização fina foi necessária para obter grandes cristais únicos de qualidade suficiente para a determinação da estrutura em resolução quase atômica. Até o momento, existem 134 estruturas de cristal de sinthase triptofano depositadas no Banco de Dados de Proteínas (PDB), contabilizando 101, 31 e 2 estruturas de cristais, respectivamente, para bactérias, arqueias e eucariotes. Bem, 73 estruturas pertencem ao s. enterica serovar typhimurium e 5 estruturas cristalinas do complexo α₂β₂StTS têm limites de resolução superiores a 1,50 Angstroms. Não surpreende que 4 em 5 foram preparados em nosso grupo de pesquisa (PDB IDs:5CGQ em 1,18 Å, 4HT3 às 1,30 Å, 4HPJ em 1.45 Å, 6DZ4 em resolução 1.45 Å). As estruturas cristalinas refinadas da forma mutante de α₂β_complexode StTS são esperadas para fornecer novas percepções sobre o mecanismo e os papéis desempenhados por resíduos essenciais de aminoácidos envolvidos na síntese L-Triptofano.

Protocol

1. Protocolo rápido para purificar a subunidade α e β e o complexo de α2β2StSrecombinado Subcloning de DNA no vetor de expressão pETSUMOObtenha o gene de acoplamento traduções (trpA e trpB) codificando as α- e βsubunidades do sintetizador triptofano da bactéria Salmonella enterica serovar typhimurium clonado no vetor de expressão pEBA-1022. Use o vetor pEBA-10 como modelo de DNA.NOTA: Alternativame…

Representative Results

Purificação da α-e βsubunidades do sindtofano synthaseA α-subunidade(αStTS) e a β-subunidade (βStTS) do triofetase de typhimurium Salmonella foram subcloradas no vetor pET SUMO modificado. A Figura 1A mostra resultados representativos da SDS-PAGE de duas bandas fortes correspondentes à proteína de fusão His6-SUMO-αStTS (pista αON…

Discussion

Nós projetamos com sucesso a forma mutante α₂β₂ βQ114A, α₂β₂ βK167T, e α₂β₂ complexos βS377A StTS para estudos de correlação estrutura-função. Inicialmente, tentamos purificar os mutantes usando um protocolo de purificação anterior²², que requer α₂β cristalização do complexoStTS₂com PEG 8000 e espermatozoide durante a purificação. Embora a taxa de cristalização dependa …

Materials

15 mL 10 kDa filter	MilliporeSigma	UFC901024	centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filter	MilliporeSigma	UFC910024	centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vials	Corning	CLS430489	Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-141	microcentrifuge tubes
24-well Cryschem Plate	Hampton Research	HR3-158	24-well sitting drop plates
2-mercaptoethanol	Fisher Scientific	O3446I-100	Chemical
50 mL centrifuge conical tubes	Thermo Scientific	12-565-270	centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET Basic	Fisher Scientific	13-636-AB15	pH meter
Agarose	Fisher Scientific	BP1356-100	Agarose gel
ammonium sulfate	Fisher Scientific	A702-500	Chemical
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5	Antibiotic
Bacterial incubator	Fisher Scientific	S35836	incubator.
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Restriction enzyme
bicine	Fisher Scientific	BP2646100	Chemical
Branson 450 Digital Sonifier	Brason	B450	Cell disruptor
Cesium chloride	Fisher Scientific	BP210-100	Chemical
Cesium hydroxide	Acros Organics	AC213601000	Chemical
Chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	Antibiotic
dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D1391	Chemical
dithiothreitol	Fisher Scientific	BP172-5	Chemical
DNA Polymerase	Thermo Scientific	F530S	HF polymerase
dNTP Set	Invitrogen	10-297-018	dNTPs set
EcoRI	New England Biolabs	R0101S	Restriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher Scientific	S311-100	Chemical
Excella E25R Orbital Shaker	Eppendorf New Brunswick	M1353-0004	Orbital incubator
GE AKTA Prime Plus	GE Healthcare	8149-30-0004	FPLC
Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012	DNA purification kit
Glycerol	Fisher Scientific	G33-500	Chemical
HindIII	New England Biolabs	R0104S	Restriction enzyme
His-Trap columns	GE Healthcare	GE17-5255-01	5 mL Histrap column
imidazole	Fisher Scientific	O3196-500	Chemical
IPTG	Thermo Fisher Scientific	R0392	Inducer
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Antibiotic
Kelvinator Series-100	Kelvinator	discontinued	Ultra low freezer
LB broth	Fisher Scientific	BP1426-500	Liquid broth
Luria Bertani agar	Fisher Scientific	BP1425-2	Solid broth
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Chemical
NcoI	New England Biolabs	R0193S	Restriction enzyme
Ni-NTA affinity beads	Thermo Fisher Scientific	R90115	Ni-NTA agarose beads
PEG 8000	Fisher Scientific	BP233-100	Chemical
phenylmethylsulfonyl fluoride	Fisher Scientific	44-865-0	Chemical
pyridoxal phosphate	Acros Organics	AC228170010	Chemical
S-200 HR	Cytiva	45-000-196	Size exclusion column
SacI	New England Biolabs	R0156S	Restriction enzyme
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-100	Chemical
Sorvall RC-5B centrifuge	Sorvall	8327-30-1004	Floor cetrifuge
Spermine	Acros Organics	AC132750010	Chemical
Superdex 200 prep grade	Cytiva	45-002-491	Size exclusion column
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S	DNA liagse
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Chemical
Ubl-specific protease 1	Thermo Scientific	12588018	SUMO Protease