Mutagénesis por PCR, clonación, expresión, protocolos rápidos de purificación de proteínas y cristalización del tipo salvaje y formas mutantes de triptófano sintasa

Summary

Este artículo presenta una serie de métodos consecutivos para la expresión y purificación de Salmonella typhimurium triptófano sintasa comp este protocolo un sistema rápido para purificar el complejo proteico en un día. Los métodos cubiertos son la mutagénesis dirigida al sitio, la expresión de proteínas en Escherichia coli,la cromatografía de afinidad, la cromatografía de filtración en gel y la cristalización.

Abstract

Se han realizado estudios estructurales con complejo bienzimático triptófano sintasa (TS) (α₂β₂ TS) de Salmonella typhimurium para comprender mejor su mecanismo catalítico, comportamiento alosterico y detalles de la transformación enzimática de sustrato a producto en enzimas dependientes de PLP. En este trabajo, un novedoso sistema de expresión para producir la subunidad β aislada α y aislada permitió la purificación de altas cantidades de subunidades puras y α complejo StTS₂β₂de las subunidades aisladas en 2 días. La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad seguida de escisión de la etiqueta de afinidad, precipitación de sulfato de amonio y cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Para comprender mejor el papel de los residuos clave en el sitio β enzima, se realizó mutagénesis directa en el sitio en estudios estructurales previos. Otro protocolo fue creado para purificar el tipo salvaje y mutante α₂β₂complejosStTS. Un protocolo simple, rápido y eficiente que utiliza fraccionamiento de sulfato de amonio y SEC permitió la purificación de α complejo₂β₂StTS en un solo día. Ambos protocolos de purificación descritos en este trabajo tienen ventajas considerables en comparación con los protocolos anteriores para purificar el mismo complejo utilizando PEG 8000 y espermina para cristalizar el complejo α₂β₂StTS a lo largo del protocolo de purificación. La cristalización de tipo salvaje y algunas formas mutantes ocurre en condiciones ligeramente diferentes, lo que perjudica la purificación de algunos mutantes utilizando PEG 8000 y esperfina. Para preparar cristales adecuados para estudios cristalográficos de rayos X se realizaron varios esfuerzos para optimizar la cristalización, la calidad de los cristales y la crioprotección. Los métodos presentados aquí deben ser generalmente aplicables para la purificación de las subunidades de triptófano sintasa y α de tipo salvaje y mutante₂β₂StTS complejos.

Introduction

El complejo bienzimático triptófano sintasa (TS) (α₂β₂₎es una enzima alostérica, catalizando los dos últimos pasos en la biosíntesis del aminoácido L-triptófano en bacterias, plantas y hongos^1,2,3. La bacteria Salmonella enterica serovar typhimurium (St)causa una infección gastrointestinal grave en humanos y otros animales. Dado que los seres humanos y los animales superiores no tienen ST (EC 4.2.1.20), la inhibición de S. typhimurium α₂β₂ complejo TS (α₂β₂StTS) se ha explorado como un posible objetivo farmacológico para el tratamiento de la criptosporidiosis y la tuberculosis^4,las infecciones genitales y oculares^5,y para la posible utilización de herbicidas en la agricultura⁶. La α-subunidad cataliza la escisión aldolítica de indol-3-glicerol-fosfato (IGP) a gliceraldehído-3-fosfato (GAP) e indol, a través de la formación de un intermedio de tautómero de indolenina y posteriormente la escisión de enlaces carbono-carbono para producir GAP e indol^3,6. El sitio β-catalítico contiene una molécula de cofactor piridoxal 5′-fosfato (PLP) unida a β-Lys87 a través de una base de Schiff, que funciona como un sumidero de electrones en el curso de las reacciones en la enzima β-subunidad^3,7. El sitio β cataliza el reemplazo del hidroxilo de cadena lateral L-Serina por indol para dar L-triptófano y una molécula de agua en una reacción dependiente de PLP. Calle TS sirve como un modelo de larga data para la investigación de la canalización de sustratos y la comunicación alotérica dentro de complejos multienzimáticos^2,3. La comunicación alostérica bidireccional entre las subunidades α y β del ST es necesaria para sincronizar los pasos catalíticos y evitar la liberación de indol durante la síntesis de L-triptófano³. Para extender este esfuerzo, hemos preparado varios mutantes (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr y β-Ser377Ala) por mutación de punto único para ser utilizados en exploraciones adicionales de la relación entre la estructura enzimática, el mecanismo y la función en el sitio catalítico de la subunidad β StTS.

La investigación detallada sobre el mecanismo catalítico de α₂β₂StTS fue iniciada por el grupo de investigación de Edith W. Miles. Los primeros estudios con Escherichia coli nativa α_{complejo 2}β₂ TS se han centrado en la purificación y caracterización del complejo α-subunidad^8,9,aislado β-subunidad^10,11 y la reconstitución del complejo TS α₂β₂ a partir de las subunidades aisladas^12. La purificación se llevó a cabo mediante precipitación de sulfato de amonio, diálisis de muestras, cromatografía DEAE-Sephadex, diálisis y una segunda ronda cromatográfica en una columna¹²de DEAE-Sephadex. En otro protocolo, se mejoró la purificación del mismo complejo cargando el lisato celular clarificado en una columna DEAE-Sephadex seguido de un paso cromatográfico en una columna Sepharose 4B, precipitación de sulfato de amonio y diálisis¹³. Ambos protocolos de purificación duran de 4 a 5 días. Escherichia coli α_{complejo TS 2}β₂ cristalizados, pero los cristales no eran adecuados para la difracción de rayos X en ese momento.

En un estudio novedoso, las formas recombinantes y de tipo salvaje de S. typhimurium α_{complejo 2}β₂ TS fueron purificadas y cristalizadas^14,15. El complejo recombinante α₂β₂StTS se sobreexpresó en la cepa CB149 de E. coli que lleva el vector de expresión pEBA-10. Se reportó la recolección de datos de cristalización inicial y difracción de rayos X y el análisis del complejo stTS_α2 β₂¹⁴. Sin embargo, agujas largas y delgadas como α_{cristales de 2}β₂StTS deterioraron los estudios estructurales. En un intento de recopilar mejores datos de difracción de rayos X, se describió otro protocolo de purificación para purificar el tipo salvaje y las formas mutantes del complejo α₂β₂StTS^15. La purificación se llevó a cabo con una precipitación inicial utilizando esperfina y PEG 8.000 en el lisato celular clarificado y se eliminó un gran precipitado voluminoso por centrifugación. La fracción sobrenadante que contenía altas cantidades de α complejo StTS_{de 2}β₂se almacenó durante 16-48 h a 4 °C hasta que los cristales amarillos precipitaron. Los cristales fueron lavados y dializado extensamente contra diferentes tampones. El complejo proteico fue recristalizado en tampón que contenía sulfato de amonio y dializado¹⁵. Aunque la cristalización de proteínas depende de las concentraciones de proteínas y precipitantes en solución, es difícil monitorear, predecir y reproducir la purificación para otras formas mutantes de α_{complejo 2}β₂StTS en solución. Este protocolo tiene la ventaja de que no utiliza ningún método cromatográfico; sin embargo, las desventajas son el largo tiempo de purificación necesario para cristalizar, dializar y recristalizar, lo que generalmente requiere de 5 a 7 días. Para obtener cristales adecuados para la recolección de datos de rayos X, se evaluaron más de 600 condiciones de cristalización utilizando una combinación y variación de concentración de proteínas, temperatura, precipitantes (PEG 4,000, 6,000 y 8,000) y aditivos (CaCl_2,MnCl_2,ZnCl_2,cadaverina, putrescina, esperfina o espermidina)¹⁵. Los cristales tenían una mejor forma cristalina y crecían más rápido en condiciones que contenían 12% de PEG 8,000 y 2 mM de espermín. La cristalización fue más favorable a 25 ° C en lugar de a 4, 30 o 42 ° C y creció a dimensiones máximas dentro de los 3 días¹⁵. Varias α₂β₂estructuras cristalinasstTS fueron reportadas en ese momento (1996-1999)^{16,17,18,19,20,21} y muchas otras estructuras se han publicado hasta la fecha.

Aquí, el propósito principal es presentar protocolos alternativos para purificar la triptófano sintasa y optimizar la cristalización de proteínas. El presente trabajo muestra mejoras significativas para purificar el tipo salvaje aislado α-subunidad (αStTS), aislado β-subunidad (βStTS), reconstituido α_{complejo St 2}β₂StTS de las subunidades aisladas, y formas salvajes tipo y mutantes del complejo α₂β₂StTS. Las ventajas sobre los protocolos anteriores son considerables, ya que el tiempo de purificación se redujo significativamente y se optimizó la cristalización y la crioprotección. Las formas mutantes de α_{complejo 2}β₂StTS diseñado en este trabajo han cristalizado cerca de la misma condición utilizada para la forma de tipo salvaje. Sin embargo, la optimización de la cristalización fina fue necesaria para obtener grandes cristales individuales de calidad suficiente para la determinación de la estructura a una resolución casi atómica. Hasta la fecha, hay 134 estructuras cristalinas de triptófano sintasa depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (PDB), lo que representa 101, 31 y 2 estructuras cristalinas, respectivamente, para bacterias, arqueas y eucariotas. Muy bien, 73 estructuras pertenecen a S. enterica serovar typhimurium y 5 estructuras cristalinas del complejo α₂β₂StTS tienen límites de resolución superiores a 1.50 Angstroms. No en vano, 4 de cada 5 fueron preparados en nuestro grupo de investigación (PDB IDs:5CGQ a 1,18 Å, 4HT3 a 1,30 Å, 4HPJ a 1,45 Å, 6DZ4 a 1,45 Å de resolución). Se prevé que las estructuras cristalinas refinadas de la forma mutante del complejo α 2_β2StTS proporcionen nuevos conocimientos sobre el mecanismo y las funciones desempeñadas por los residuos de aminoácidos esenciales involucrados en la síntesis de L-triptófano.

Protocol

1. Protocolo rápido para purificar la subunidad α y β y el complejo recombinado α2β2StTS Subclonización de ADN en vector de expresión pETSUMOObtener el gen de acoplamiento traslacional (trpA y trpB) que codifica las α- y β- subunidades de la triptófano sintasa de la bacteria Salmonella enterica serovar typhimurium clonada en el vector de expresión pEBA-1022. Utilice el vector pEBA-10 como plantilla de A…

Representative Results

Purificación de las αy βsubunidades de la triptófano sintasaLa α-subunidad(αStTS) y la β-subunidad (βStTS) de la Salmonella typhimurium triptófano sintasa fueron subclaonadas en el vector pET SUMO modificado. La Figura 1A muestra resultados representativos de SDS-PAGE de dos bandas fuertes correspondientes a la proteína de fusión His6-SUMO-…

Discussion

Hemos diseñado con éxito la forma mutante α₂β₂ βQ114A, α₂β₂ βK167T y α₂β_{2 complejos} βS377A StTS para estudios de correlación estructura-función. Inicialmente, hemos intentado purificar los mutantes utilizando un protocolo de purificación previo^22,que requiere α cristalización del complejo₂β₂StTS con PEG 8000 y esperfina durante la purificación. Aunque la tasa de cristalizaci?…

Materials

15 mL 10 kDa filter	MilliporeSigma	UFC901024	centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filter	MilliporeSigma	UFC910024	centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vials	Corning	CLS430489	Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-141	microcentrifuge tubes
24-well Cryschem Plate	Hampton Research	HR3-158	24-well sitting drop plates
2-mercaptoethanol	Fisher Scientific	O3446I-100	Chemical
50 mL centrifuge conical tubes	Thermo Scientific	12-565-270	centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET Basic	Fisher Scientific	13-636-AB15	pH meter
Agarose	Fisher Scientific	BP1356-100	Agarose gel
ammonium sulfate	Fisher Scientific	A702-500	Chemical
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5	Antibiotic
Bacterial incubator	Fisher Scientific	S35836	incubator.
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Restriction enzyme
bicine	Fisher Scientific	BP2646100	Chemical
Branson 450 Digital Sonifier	Brason	B450	Cell disruptor
Cesium chloride	Fisher Scientific	BP210-100	Chemical
Cesium hydroxide	Acros Organics	AC213601000	Chemical
Chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	Antibiotic
dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D1391	Chemical
dithiothreitol	Fisher Scientific	BP172-5	Chemical
DNA Polymerase	Thermo Scientific	F530S	HF polymerase
dNTP Set	Invitrogen	10-297-018	dNTPs set
EcoRI	New England Biolabs	R0101S	Restriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher Scientific	S311-100	Chemical
Excella E25R Orbital Shaker	Eppendorf New Brunswick	M1353-0004	Orbital incubator
GE AKTA Prime Plus	GE Healthcare	8149-30-0004	FPLC
Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012	DNA purification kit
Glycerol	Fisher Scientific	G33-500	Chemical
HindIII	New England Biolabs	R0104S	Restriction enzyme
His-Trap columns	GE Healthcare	GE17-5255-01	5 mL Histrap column
imidazole	Fisher Scientific	O3196-500	Chemical
IPTG	Thermo Fisher Scientific	R0392	Inducer
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Antibiotic
Kelvinator Series-100	Kelvinator	discontinued	Ultra low freezer
LB broth	Fisher Scientific	BP1426-500	Liquid broth
Luria Bertani agar	Fisher Scientific	BP1425-2	Solid broth
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Chemical
NcoI	New England Biolabs	R0193S	Restriction enzyme
Ni-NTA affinity beads	Thermo Fisher Scientific	R90115	Ni-NTA agarose beads
PEG 8000	Fisher Scientific	BP233-100	Chemical
phenylmethylsulfonyl fluoride	Fisher Scientific	44-865-0	Chemical
pyridoxal phosphate	Acros Organics	AC228170010	Chemical
S-200 HR	Cytiva	45-000-196	Size exclusion column
SacI	New England Biolabs	R0156S	Restriction enzyme
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-100	Chemical
Sorvall RC-5B centrifuge	Sorvall	8327-30-1004	Floor cetrifuge
Spermine	Acros Organics	AC132750010	Chemical
Superdex 200 prep grade	Cytiva	45-002-491	Size exclusion column
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S	DNA liagse
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Chemical
Ubl-specific protease 1	Thermo Scientific	12588018	SUMO Protease