PCR 돌연변이 발생, 복제, 발현, 빠른 단백질 정화 프로토콜 및 트립토판 신타제의 야생 유형 및 돌연변이 형태의 결정화
Summary
이 문서는 살모넬라 타이피무륨 트립토판 synthase의 발현 및 정화를 위한 일련의 연속적인 방법을 제시하며, 이 프로토콜은 하루에 단백질 복합체를 정화하는 신속한 시스템이다. 커버되는 방법은 현장 지향 돌연변이 발생, 대장균의단백질 발현, 친화 성염색로그래피, 젤 여과 크로마토그래피 및 결정화입니다.
Abstract
살모넬라 타이피무륨의 트립토판 신체(TS) 바이엔자임 복합체(α2β2 TS)를 함유한 구조 연구는 촉매 메커니즘, 알로스터식 거동, 그리고 PLP 의존 효소에서 제품에 기판의 효소 변환에 대한 세부 사항을 더 잘 이해하기 위해 수행되었습니다. 이 작품에서, 고립된 α 및 고립된 β 서브유닛을 생성하는 새로운 표현 시스템은 2일 이내에 고립된 서브유닛으로부터 고량의 순수 서브유닛과 α2 β2stTS 콤플렉스의 정화를 허용하였다. 정제는 친화성 크로마토그래피에 의해 수행되었고, 그 다음으로 친화태그, 황산암모늄 강수량 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 분열이 뒤따랐다. 효소 β 부위의 주요 잔류물의 역할을 더 잘 이해하기 위해, 현장 직접 돌연변이 발생은 이전 구조 연구에서 수행되었다. 또 다른 프로토콜은 야생 유형과 돌연변이 α2β2세인트TS 단지를 정화하기 위해 만들어졌습니다. 암모늄 황산염 분획 및 SEC를 사용하는 간단하고 빠르고 효율적인 프로토콜은 하루에2β2StTS 단지의 α 정화할 수 있었습니다. 이 작업에 기재된 두 정제 프로토콜은 이전 프로토콜과 비교하여 PEG 8000및 spermine을 사용하여 동일한 복합체를 정화하여 정화 프로토콜을 따라 α2β2stTS 단지를 결정화할 때 상당한 이점이 있다. 야생 유형 및 일부 돌연변이 형태의 결정화는 PEG 8000 및 spermine을 사용하여 일부 돌연변이체의 정제를 손상시키는 약간 다른 조건에서 발생합니다. 엑스레이 결정학 연구에 적합한 결정을 준비하기 위해 결정화, 결정 품질 및 냉동 보호를 최적화하기 위해 몇 가지 노력을기울였습니다. 여기에 제시 된 방법은 일반적으로 트립토판 synthase 서브 유닛과 야생 유형 및 돌연변이 α2β2세인트TS 단지의 정화에 적용해야합니다.
Introduction
트립토판 신타제(TS) 바이엔자임 복합체(α2 β 2)는알로스터 효소로, 박테리아, 식물, 곰팡이1,2,3에서아미노산 L-트립토판의 생합성에서 마지막 두 단계를 촉매한다. 박테리아 살모넬라 장내 세로바 티피무리움 (St)은인간과 다른 동물에서 심각한 위장 감염을 일으킨다. 인간과 더 높은 동물은 TS(EC 4.2.1.20)가 없기 때문에, S. typhimurium α2β2 TS 복합체 (α2β2StTS)의 억제는 크립토스포리디오스및 결핵4,생식기 및 안구 감염5,그리고잠재적인 그녀의 발동을 위한 잠재적 인 약물 대상으로 탐구되었습니다. α 서브유닛은 인돌-3-글리세롤-인산염(IGP)의 알돌리틱 분열을 글리세랄데히드-3-인산염(GAP)과 인돌로 촉매하여, 인돌닌 타우토머 중간체및 그 후 카본-카본 결합 분열의 형성을 통해 GAP및 인돌3,6을생성한다. β 촉매 부위에는 쉬프 베이스를 통해 β-Lys87에 결합된 피리독살 5′-인산염(PLP) 보조 분자가 포함되어 있으며, 이는 효소 β 서브유닛3,7에서반응하는 과정에서 전자 싱크로 기능한다. β 사이트는 L-트립토판과 PLP 의존 반응에서 물 분자를 제공하기 위해 인돌에 의해 L-세린 사이드 체인 하이드록실의 교체를 촉매한다. 세인트 (주) TS는 다효소 복합체2,3내의 기질 채널링 및 알로스터통신을 조사하는 오랜 모델역할을 한다. TS의 α 및 β 서브유닛 간의 양방향 알로스터 통신은 L-트립토판 합성3동안 촉매 단계를 동기화하고 인돌 방출을 방지할 필요가 있다. 이러한 노력을 확장하기 위해, 우리는 여러 돌연변이 (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr 및 β-Ser377Ala)를 단일 지점 돌연변이로 제조하여 효소 구조, 메커니즘 및 세인트TS β 서브 유닛의 촉매 부위에서의 관계의 추가 탐구에 사용할 수 있습니다.
α2β2StTS의 촉매 메커니즘에 대한 자세한 연구는 에디스 W. 마일즈의 연구 그룹에 의해 시작되었습니다. 네이티브 대장균 α2 β2 TS 복합체를 통한 초기 연구는 격리된 α 서브유닛8,9,격리된 β 서브유닛10,11 및 α2 β 2TS 단지의 재구성에 초점을 맞추고 있다12. 정제는 황산염 강수량 암모늄, 샘플 투석, DEAE-세바덱스 크로마토그래피, 투석 및 DEAE-Sephadex 컬럼12에대한 제2 크로마토그래피 라운드에 의해 수행되었다. 또 다른 프로토콜에서, 동일한 복합체의 정제는 DEAE-Sephadex 컬럼에 정제된 세포 용재를 적재하고 세파로즈 4B 컬럼, 황산암모늄 강수량 및투석(13)에크로마토그래피 단계를 거쳐 개선되었다. 두 정화 프로토콜모두 4-5일 동안 지속됩니다. 대장균 α2 β2 TS 복합체는 결정화되었지만 그 당시 의결은 X선 회절에 적합하지 않았다.
새로운 연구에서는, 재조합 및 야생형 형태의 S. typhimurium α2β2 TS 복합체는14,15로정결되었다. 재조합 α2β2stTS 복합체는 pEBA-10 발현 벡터를 운반하는 대장균 CB149로 과발현되었다. 초기 결정화 및 X선 회절 데이터 수집 및 분석α2β2StTS 복합체의 분석은14보고되었다. 그러나, α 같은 길고 얇은 바늘2β2세인트TS 크리스탈 구조 연구를 손상. 더 나은 X선 회절 데이터를 수집하기 위해, 또 다른 정화 프로토콜은 α2β2StTS 복합체15의야생 유형 및 돌연변이 형태를 정화하기 위해 설명되었다. 정화는 스퍼민과 PEG 8,000을 사용하여 초기 침전을 명확히 된 세포 용액으로 수행하였고 큰 부피가 큰 침전물을 원심분리에 의해 제거하였다. α 2 β2세인트TS복합체의 높은 양을 포함하는 상주 분획은 황색 결정이 침전될 때까지 4°C에서 16-48h로 저장하였다. 크리스탈은 다른 버퍼에 대해 세척하고 광범위하게 투석되었습니다. 단백질 복합체는 황산암모늄을 함유하는 완충액으로재결정되었고, 투석15. 단백질 결정화는 용액의 단백질 및 침전물 농도에 따라 달라지지만, 용액에서 다른 돌연변이 형태인 α2β2StTS 콤플렉스에 대한 정화를 모니터링, 예측 및 재현하기는 어렵다. 이 프로토콜은 크로마토그래피 방법을 사용하지 않는다는 장점이 있습니다. 그러나, 단점은 결정화, 투석 및 재결정화에 필요한 긴 정화 시간이며, 전형적으로 5-7일이 필요하다. X선 데이터 수집에 적합한 결정을 얻기 위해 600개 이상의 결정화 조건은 단백질 농도, 온도, 강수제(PEG 4,000, 6,000 및 8,000) 및 첨가제(CaCl2,MnCl2,ZnCl2,카다베린, 퍼드린, 퍼드린, 스프레딘, 스프레시네, 스프레딘, 스프레시네,15. 크리스탈은 더 나은 결정 형태를 가지고 있었고 12 % PEG 8,000 및 2 mM 스페민을 포함하는 조건에서 더 빠르게 성장했습니다. 결정화는 4, 30 또는 42°C보다 25°C에서 더 유리했으며3일 15일이내에 최대 치수로 성장하였다. 몇몇α2β 2StTS 결정 구조물은 그 당시 (1996-1999)16,17,18,19,20,21 및 그밖 많은 구조물이 현재까지 간행되었습니다 보고되었습니다.
여기서 주요 목적은 트립토판 신체화를 정화하고 단백질 결정화를 최적화하기 위한 대체 프로토콜을 제시하는 것입니다. 본 작품은 야생형 절연 α 서브유닛(αStTS), 격리된 β 서브유닛(βStTS), α2 β2st TS 복합체, α2 β2StTS 복합체의 야생형 및 돌연변이 형태 를 정화하는 상당한 개선을보여준다. 정제 시간이 현저히 단축되고 결정화 및 극저온 보호가 최적화되었기 때문에 과거의 프로토콜에 비해 이점이 상당합니다. 이 작품에서 설계된 α2β2세인트TS 복합체의 돌연변이 형태는 야생 형 형태에 사용되는 동일한 조건 근처에서 결정화되었습니다. 그러나, 미세 결정화 최적화는 거의 원자 분해능에서 구조 판정을 위한 충분한 품질의 큰 단결정획득이 필요하였다. 현재까지, 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 증착된 134개의 트립토판 신체 결정 구조물이 있으며, 각각 101, 31 및 2개의 결정 구조를 각각 박테리아, 고고학 및 진핵생물에 대해 회계합니다. 멋지게, 73 구조는 S. 엔테리카 세로바 티피무륨에 속하고 5 α 의 5 결정 구조2β2세인트TS 단지는 1.50 Angstroms보다 높은 해상도 한계를 가지고있다. 당연히, 4 아웃 5 우리의 연구 그룹에서 준비 되었다 (PDB IDs:5CGQ 에서 1.18 Å, 4HT3 에서 1.30 Å, 4HPJ 에서 1.45 Å, 6DZ4 에서 1.45 Å 해상도). α2β2StTS 복합체의 돌연변이 형태의 정제 된 결정 구조는 L-트립토판 합성에 관련된 필수 아미노산 잔류물이 연주 되는 메커니즘과 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 것으로 예상됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 성공적으로 구조 기능 상관 관계 연구를위한2β2 βQ114A, α2β2 βK167T,α2 β2 βS377A 세인트TS 복합체를 α 돌연변이 형태를 성공적으로 설계했다. 처음에, 우리는 이전 정화 프로토콜을 사용하여 돌연변이를 정화하기 위해 노력했다22,이는 정제 하는 동안 PEG 8000 및 spermine와 α2β2세인트TS 복합 결정?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미국 국립 보건원 (GM097569)에 의해 지원되었다.
Materials
| 15 mL 10 kDa filter | MilliporeSigma | UFC901024 | centrifugal filter unit |
| 15 mL 100 kDa filter | MilliporeSigma | UFC910024 | centrifugal filter unit |
| 2 mL cryogenic vials | Corning | CLS430489 | Cryogenic vials |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-141 | microcentrifuge tubes |
| 24-well Cryschem Plate | Hampton Research | HR3-158 | 24-well sitting drop plates |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | Chemical |
| 50 mL centrifuge conical tubes | Thermo Scientific | 12-565-270 | centrifuge conical tubes |
| AB15 ACCUMET Basic | Fisher Scientific | 13-636-AB15 | pH meter |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | Agarose gel |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | Chemical |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | Antibiotic |
| Bacterial incubator | Fisher Scientific | S35836 | incubator. |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| bicine | Fisher Scientific | BP2646100 | Chemical |
| Branson 450 Digital Sonifier | Brason | B450 | Cell disruptor |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | BP210-100 | Chemical |
| Cesium hydroxide | Acros Organics | AC213601000 | Chemical |
| Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | Antibiotic |
| dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D1391 | Chemical |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172-5 | Chemical |
| DNA Polymerase | Thermo Scientific | F530S | HF polymerase |
| dNTP Set | Invitrogen | 10-297-018 | dNTPs set |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | Restriction enzyme |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chemical |
| Excella E25R Orbital Shaker | Eppendorf New Brunswick | M1353-0004 | Orbital incubator |
| GE AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 8149-30-0004 | FPLC |
| Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | DNA purification kit |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Chemical |
| HindIII | New England Biolabs | R0104S | Restriction enzyme |
| His-Trap columns | GE Healthcare | GE17-5255-01 | 5 mL Histrap column |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | Chemical |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Inducer |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Antibiotic |
| Kelvinator Series-100 | Kelvinator | discontinued | Ultra low freezer |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Liquid broth |
| Luria Bertani agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Solid broth |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Chemical |
| NcoI | New England Biolabs | R0193S | Restriction enzyme |
| Ni-NTA affinity beads | Thermo Fisher Scientific | R90115 | Ni-NTA agarose beads |
| PEG 8000 | Fisher Scientific | BP233-100 | Chemical |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | 44-865-0 | Chemical |
| pyridoxal phosphate | Acros Organics | AC228170010 | Chemical |
| S-200 HR | Cytiva | 45-000-196 | Size exclusion column |
| SacI | New England Biolabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Chemical |
| Sorvall RC-5B centrifuge | Sorvall | 8327-30-1004 | Floor cetrifuge |
| Spermine | Acros Organics | AC132750010 | Chemical |
| Superdex 200 prep grade | Cytiva | 45-002-491 | Size exclusion column |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA liagse |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Chemical |
| Ubl-specific protease 1 | Thermo Scientific | 12588018 | SUMO Protease |
Referencias
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