Reprogrammation directe des fibroblastes humains en myoblastes pour étudier les thérapies pour les troubles neuromusculaires
Summary
Ce protocole décrit la conversion des fibroblastes cutanés en myoblastes et leur différenciation en myotubes. Les lignées cellulaires sont dérivées de patients atteints de troubles neuromusculaires et peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes pathologiques et tester des stratégies thérapeutiques.
Abstract
Les investigations sur la pathophysiologie et les cibles thérapeutiques dans les dystrophies musculaires ont été entravées par la capacité proliférative limitée des myoblastes humains. Plusieurs modèles muraux ont été créés, mais ils ne représentent pas vraiment la physiopathologie humaine de la maladie ou ne sont pas représentatifs du large spectre de mutations trouvées chez l’homme. L’immortalisation des myoblastes primaires humains est une alternative à cette limitation; cependant, il est toujours dépendant des biopsies musculaires, qui sont invasives et pas facilement disponibles. En revanche, les biopsies cutanées sont plus faciles à obtenir et moins invasives pour les patients. Les fibroblastes dérivés de biopsies cutanées peuvent être immortalisés et transdifférenciés en myoblastes, fournissant une source de cellules avec un excellent potentiel myogénique. Ici, nous décrivons une méthode de reprogrammation rapide et directe du fibroblaste en lignée myogénique. Les fibroblastes sont transduced avec deux lentivirus : hTERT pour immortaliser la culture primaire et un MYODtet-inducible, qui sur l’addition de la doxycycline, induit la conversion des fibroblastes en myoblastes et puis myotubes mûrs, qui expriment des marqueurs tardifs de différenciation. Ce protocole de transdifferentiation rapide représente un outil puissant pour étudier les mécanismes pathologiques et étudier les biothérapies innovantes basées sur les gènes ou pharmacologiques pour les troubles neuromusculaires.
Introduction
Les modèles cellulaires obtenus directement à partir de tissus humains sont utiles pour modéliser de nombreux troubles génétiques humains, avec l’avantage d’avoir le contexte génomique original et, dans de nombreux cas, de reproduire les mêmes caractéristiques moléculaires et cellulaires observées chez les patients. Dans le domaine des troubles neuromusculaires, les biopsies musculaires ont été une grande source de myoblastes humains et ont contribué à l’élucidation des mécanismes pathologiques. En outre, ils sont un outil important pour les tests in vivo des médicaments et des thérapies géniques. D’une part, la dérivation des myoblastes à partir de fragments musculaires est relativement facile. D’autre part, la culture et le maintien des myoblastes primaires sont difficiles, en raison de leur taux de prolifération limité et de leur sénescence réplicative in vitro1. Une alternative pour ces limitations est d’immortaliser les myoblastes avec l’insertion de la télomérase humaine (hTERT) et / ou kinase dépendante de la cycline 4 (CDK4) gènes2,3, avec la préservation des caractéristiques musculaires squelettiques4. Néanmoins, l’obtention des myoblastes primaires dépend toujours de la biopsie de muscle, une procédure chirurgicale avec des inconvénients aux patients, qui, dans beaucoup de cas, ont leurs muscles dans la dégénérescence avancée. Ainsi, le muscle de ces patients est composé d’une proportion significative de tissu fibrotique et/ou adipeux et donne moins de cellules musculaires, nécessitant la purification des cellules précédemment à l’immortalisation.
Contrairement aux biopsies musculaires, les biopsies cutanées sont plus accessibles et moins nocives pour les patients. Les fibroblastes primaires peuvent être dérivés de fragments de peau in vitro. Bien que les fibroblastes ne soient pas principalement affectés par des mutations causant des désordres neuromusculaires, ils peuvent être transdifferentiated dans les myoblastes. Ceci peut être réalisé par l’insertion du gène Myod, un facteur de transcription réglementaire myogénique5. Dans ce manuscrit, nous décrivons le protocole d’obtention des myoblastes transdifferentiated, de l’établissement des cultures de fibroblastes à l’obtention des myotubes différenciés (un résumé représentatif de la méthode est représenté dans la figure 1).
L’essai préclinique des stratégies thérapeutiques dépend des modèles cellulaires et animaux portant des mutations semblables aux mutations trouvées dans les patients humains. Bien que le développement de modèles animaux soit devenu plus réalisable avec l’avancée des technologies d’édition génétique telles que CRISPR/Cas96,il reste difficile et coûteux. Ainsi, les lignées cellulaires dérivées du patient sont une option accessible pour avoir des modèles, couvrant le large spectre de mutations de maladies telles que la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L’obtention et la création de modèles cellulaires sont cruciales pour le développement de thérapies personnalisées pour de telles pathologies.
Parmi les thérapies personnalisées qui ont été étudiées, les stratégies de saut d’exon sont l’une des prometteuses pour différentes dystrophiesmusculaires 7,8. Cette stratégie consiste à produire une protéine plus courte mais fonctionnelle. Ceci est effectué en cachant la définition d’exon à l’épissage, excluant ainsi l’exon muté du messager final. Il s’agit d’une technologie très prometteuse qui a été approuvé par la FDA pour le DMD. Ainsi, nous décrivons également dans ce protocole, des méthodes pour transfecter des myoblastes avec deux technologies liées de saut d’exon différentes : oligonucleotides antisens (AON) et virus U7snRNA-adeno-associés (AAV). La transfection AON est un bon outil pour le criblage initial de plusieurs séquences conçues pour favoriser le saut d’exon9. Toutefois, l’activité des OPN est transitoire. Afin d’obtenir une expression soutenue des séquences antisens, nous avons également exploré de petits ARN nucléaires (ARNR) combinés à l’AAV, permettant la localisation et l’inclusion nucléaires dans les machines d’épissage10. U7 est un ARNR impliqué dans le traitement de l’ARNm histone qui peut être conçu pour lier les protéines qui vont le rediriger vers le spliceosome et livrer des séquences antisens11. L’utilisation de snARN U7 modifiés en combinaison avec des vecteurs AAV surmonte les limites des ANO, ce qui entraîne une expression continue des ANO et une meilleure transduction des tissus d’intérêt12. Nous utilisons des cellules dérivées de patients atteints de DMD pour ce protocole pour illustrer la stratégie d’exon-saut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour obtenir des lignes cellulaires FM de bonne qualité, certaines étapes sont critiques. Plus tôt la biopsie de la peau est traitée, plus les chances sont grandes d’obtenir des fibroblastes sains. Le nombre de cultures de passage de fibroblastes est également important. Les cellules primaires ont une capacité proliférative limitée et après de nombreux passages, elles entrent dans la sénescence réplicative. Ainsi, il est préférable d’avoir un stock de fibroblastes à un faible nombre de passage et de tra…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Vincent Mouly d’avoir partagé ses connaissances dans le passé sur le modèle. Ces travaux ont été soutenus par le National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., et R.B.W.),les National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., et N.W.). N.W. a reçu le soutien de la Bourse de l’Université d’État de l’Ohio/Nationwide Children’s Hospital Muscle Group et de la Fondation Philippe. Ce travail a également été soutenu par des fonds discrétionnaires internes et une partie du travail de saut exon 2 a également été soutenue par CureDuchenne (K.M.F.) et l’Association Française Contre Les Myopathies. Numéro de la CISR : CISR #: IRB10-00358/ CR00005138 et IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
Referencias
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