Прямое перепрограммирование фибробластов человека в миобласты для исследования терапии нервно-мышечных расстройств
Summary
Этот протокол описывает преобразование фибробластов кожи в миобласты и их дифференциацию в миотрубы. Клеточные линии получены от пациентов с нервно-мышечными расстройствами и могут быть использованы для исследования патологических механизмов и для проверки терапевтических стратегий.
Abstract
Исследования как патофизиологии, так и терапевтических целей в мышечной дистрофии были затруднены ограниченной пролиферативной способностью миобластов человека. Несколько моделей мыши были созданы, но они либо действительно не представляют человека физиопатологии болезни или не являются репрезентативными широкого спектра мутаций, найденных в организме человека. Увековечение первичных миобластов человека является альтернативой этому ограничению; однако, он по-прежнему зависит от биопсии мышц, которые являются инвазивными и не легко доступны. В отличие от этого, биопсия кожи легче получить и менее инвазивными для пациентов. Фибробласты, полученные из биопсии кожи, могут быть увековечены и трансдифференцированы в миобласты, обеспечивая источник клеток с отличным миогенным потенциалом. Здесь мы описываем быстрый и прямой метод перепрограммирования фибробласта в миогенную линию. Фибробласты трансдуцируются двумя лентивирусами: hTERT, чтобы увековечить первичную культуру и тет-индуцируемых MYOD, который при добавлении доксициклина, вызывает преобразование фибробластов в миобласты, а затем зрелые миотрубы, которые выражают конце дифференциации маркеров. Этот быстрый протокол трансдифференцирования представляет собой мощный инструмент для исследования патологических механизмов и исследования инновационных генных или фармакологических биотерапии нервно-мышечных расстройств.
Introduction
Клеточные модели, полученные непосредственно из тканей человека, полезны для моделирования многих генетических нарушений человека, с преимуществом наличия оригинального геномного контекста и, во многих случаях, воспроизведения тех же молекулярных и клеточных признаков, наблюдаемых у пациентов. В области нервно-мышечных расстройств, биопсия мышц были отличным источником миобластов человека и помогли в выяснении патологических механизмов. Кроме того, они являются важным инструментом для in vivo тестирования препаратов и генной терапии. С одной стороны, вывод миобластов из фрагментов мышц относительно прост. С другой стороны, культура и поддержание первичных миобластов являются сложными, из-за их ограниченной скорости распространения и репликации сенесценции в пробирке1. Альтернативой этим ограничениям является увековечение миобластов с вставкой человеческой теломеразы(HTERT)и/или циклин-зависимой киназы 4 (CDK4)генов 2,3, с сохранением скелетных мышечных особенностей4. Тем не менее, убаюка первичных миобластов по-прежнему зависит от биопсии мышц, хирургической процедуры с недостатками для пациентов, которые, во многих случаях, имеют свои мышцы в продвинутой дегенерации. Таким образом, мышцы этих пациентов состоят из значительной доли фиброзной и/или жировой ткани и дают меньше мышечных клеток, требующих очищения клеток ранее к увековечению.
В отличие от биопсии мышц, биопсия кожи более доступна и менее вредна для пациентов. Первичные фибробласты могут быть получены из фрагментов кожи в пробирке. Хотя фибробласты в первую очередь не страдают от мутаций, вызывающих нервно-мышечные расстройства, они могут быть трансдифференцированы в миобласты. Это может быть достигнуто путем вставки гена Myod, миогенного регулятивного транскрипции фактора5. В этой рукописи мы описываем протокол для получения трансдифференцированных миобластов, от создания фибробластов культур до одержимости дифференцированных миотрубов (репрезентативное резюме метода изображено на рисунке 1).
Доклиническое тестирование терапевтических стратегий зависит от клеточных и животных моделей, несущих мутации, аналогичные мутациям, обнаруженным у пациентов. Хотя разработка моделей животных стала более осуществимой с развитием технологий редактирования генов, таких как CRISPR/Cas96,она по-прежнему является сложной и дорогостоящей. Таким образом, клеточные линии, полученные пациентом, являются доступным вариантом для моделей, охватывающих большой спектр мутаций таких заболеваний, как мышечная дистрофия Дюшенна (DMD). Использование и создание клеточных моделей имеют решающее значение для разработки персонализированной терапии таких патологий.
Среди персонализированных методов лечения, которые были исследованы, exon пропуская стратегии является одним из перспективных для различных мышечныхдистрофий 7,8. Эта стратегия состоит из производства более короткого, но функционального белка. Это выполняется путем сокрытия определения exon к сплайсоме, поэтому исключает мутировавшего экзона из конечного посланника. Это очень перспективная технология, которая была одобрена FDA для DMD. Таким образом, мы также описываем в этом протоколе, методы трансфект миобластов с двумя различными эксон пропуска соответствующих технологий: антисенс олигонуклеотиды (AON) и U7snRNA-адено-ассоциированных вирусов (AAV). AON transfection является хорошим инструментом для первоначального скрининга нескольких последовательностей, предназначенных для содействия exon пропуск9. Тем не менее, деятельность AONs является преходящим. Чтобы получить устойчивое выражение антисенсных последовательностей, мы также исследовали небольшие ядерные РНК (snRNAs) в сочетании с AAV, что позволяет ядерной локализации и включения в сращиваниямашины 10. U7 является snRNA, участвующих в обработке гистона мРНК, которые могут быть разработаны, чтобы связать белки, которые будут перенаправлять его в сплайсеосомы и доставить антисенспоследовательности 11. Использование модифицированных SNRNAs U7 в сочетании с векторами AAV преодолевает ограничения AONs в результате продолжающегося выражения AONs и лучшей трансдукции тканей, представляющихинтерес 12. Мы используем клетки, полученные от пациентов DMD для этого протокола, чтобы проиллюстрировать экзон-пропуск стратегии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для получения FM-клеток линий с хорошим качеством, некоторые шаги имеют решающее значение. Чем раньше будет обработана биопсия кожи, тем больше шансов получить здоровые фибробласты. Прохождение числа фибробластов культур также имеет важное значение. Первичные клетки имеют ограниченну?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Винсента Мули за то, что он поделился своими знаниями в прошлом в отношении этой модели. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения США Национальный институт неврологических расстройств и инсульта (R01 NS043264 (K.M.F., и Р.B.В.)), Национальный институт здравоохранения США Национальный институт артрита и опорно-двигательного и кожных заболеваний (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., и N.W.). N.W. получил стипендианую поддержку от Университета штата Огайо/Национальной детской больницы Muscle Group и Фонда Филиппа. Эта работа была также поддержана внутренними дискреционными фондами, и часть exon 2 пропуск работы была поддержана также CureDuchenne (K.M.F.) и Ассоциация Франсез Контре Les Myopathies. Номер IRB: IRB: IRB10-00358/ CR00005138 и IBCSC: IBS00000123.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
Referencias
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
- Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
- Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43 (2016).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
- Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5 (2019).
- Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
- De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
- Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
- Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
- Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Biología del desarrollo. 265 (2), 294-301 (2004).
