神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング
Summary
このプロトコルは、皮膚線維芽細胞を筋芽細胞に変換し、その分化を筋管に変換することを記述する。細胞株は神経筋疾患の患者に由来し、病理学的メカニズムを調査し、治療戦略をテストするために使用することができる。
Abstract
筋ジストロフィーにおける病態生理学と治療標的の両方に関する調査は、ヒト近母細胞の限られた増殖能力によって妨げられている。いくつかのマウスモデルが作成されましたが、彼らは本当に病気の人間の生理病理学を表していないか、ヒトに見られる突然変異の広いスペクトルを代表していません。ヒトの原発筋細胞の不死化は、この制限に代わるものである。しかし、それはまだ侵襲的で簡単に利用できない筋肉生検に依存しています。対照的に、皮膚生検は患者に対して入手しやすく、侵襲性が低い。皮膚生検に由来する線維芽細胞は、不死化し、筋芽細胞にトランスファノファナイズすることができ、優れた筋形成電位を有する細胞の供給源を提供する。ここでは、線維芽細胞を筋原性系統に迅速かつ直接的にリプログラミングする方法について述べている。線維芽細胞は2つのレンチウイルスでトランスタイブされる:一次培養を不滅にする hTERT とテト誘導性 MYODは、ドキシサイクリンの添加時に線維芽細胞を筋芽細胞に変換し、その後、後期分化マーカーを発現する成熟した筋芽細胞の変換を誘導する。この迅速なトランスセ分化プロトコルは、病理学的メカニズムを調査し、神経筋疾患に対する革新的な遺伝子ベースまたは薬理学的生物療法を調査するための強力なツールを表しています。
Introduction
ヒト組織から直接得られた細胞モデルは、元のゲノムコンテキストを有し、多くの場合、患者に観察された同じ分子および細胞の特徴を再現するという利点を有する多くのヒト遺伝性疾患をモデル化するのに有用である。神経筋疾患の分野では、筋肉生検はヒト重芽細胞の大きな源であり、病理学的メカニズムの解明に役立っています。さらに、それらは、薬物および遺伝子治療のインビボ試験のための重要なツールである。一方で、筋断片からの筋芽細胞の導出は比較的容易である。一方、プライマリ・ミオブラテストの培養や維持は、その増殖速度が限られており、vitro1では老化が反復的であるため、困難である。これらの制限の代替は、骨格筋特徴4の保存を伴うヒトテロメラーゼ(hTERT)および/またはサイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)遺伝子2、3を挿入して筋芽細胞を不死化させることである。それにもかかわらず、原発性筋芽細胞の鈍化は、多くの場合、進行した変性において筋肉を有する患者に不利益を伴う外科的処置である筋肉生検に依然として依存している。したがって、これらの患者の筋肉は、線維性および/または脂肪組織の有意な割合で構成され、より少ない筋肉細胞を生み出し、以前は不死化に細胞の精製を必要とする。
筋肉生検とは対照的に、皮膚生検はよりアクセスしやすく、患者にとって有害性が低い。原発性線維芽細胞は、 インビトロの皮膚断片に由来する。線維芽細胞は主に神経筋障害を引き起こす突然変異の影響を受けませんが、筋芽細胞にトランス分化することができます。これは 、ミオド 遺伝子の挿入によって達成され得る、筋原性調節転写因子5.本稿では、線維芽細胞培養の確立から分化された筋管の隠れにまで、トランス分化された筋芽細胞を得るためのプロトコルについて述べる(この方法の代表的な要約は 図1に示されている)。
治療戦略の前臨床検査は、ヒト患者に見られる突然変異と同様の突然変異を運ぶ細胞および動物モデルに依存する。CRISPR/Cas96などの遺伝子編集技術の進歩により、動物モデルの開発は実現可能になりましたが、依然として困難でコストがかかります。したがって、患者由来細胞株は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)などの疾患の突然変異の大きなスペクトルをカバーするモデルを有するアクセス可能な選択肢である。細胞モデルの隠れと作成は、このような病理のためのパーソナライズされた治療法の開発に不可欠です。
調査されたパーソナライズされた治療法の中で、エキソンスキップ戦略は、異なる筋ジストロフィー7、8のための有望なものの一つです。この戦略は、より短いが機能的なタンパク質を産生する。これは、最終的なメッセンジャーから変異したエキソンを除外して、スプライセソームにエキソン定義を隠すことによって実行されます。これは、DMDのためのFDAによって承認されている非常に有望な技術です.したがって、我々はまた、このプロトコル、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)およびU7snRNA-アデノ関連ウイルス(AAV)の2つの異なるエキソンスキップ関連技術を有するミコールトをトランスフェクトする方法を記述する。AONトランスフェクションは、エキソンスキップ9を促進するように設計されたいくつかの配列の初期スクリーニングのための良いツールです。ただし、AnIN のアクティビティは一時的なものです。アンチセンス配列の持続的発現を得るために、我々はまた、AAVと結合した小型核RNA(snRNA)を探索し、核の局在化およびスプライシング機構10への包含を可能にした。U7は、スプライセソームにリダイレクトし、アンチセンス配列11を送達するタンパク質を結合するように操作することができるヒストンmRNAの処理に関与するsnRNAである。AAVベクターと組み合わせて修飾されたU7 snRNAを使用すると、AINの継続的な発現および関心のある組織の優れた伝達をもたらすAOの限界を克服する。このプロトコルにはDMD患者由来の細胞を使用して、エキサボッピング戦略を説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
良質のFM細胞株を得るためには、いくつかのステップが重要です。皮膚生検が早く処理されるほど、健康な線維芽細胞を得る可能性が高くなります。線維芽細胞培養の通過数も重要である。原発細胞は増殖能力が限られており、多くの通過後、それらは複製老化に入る。したがって、できるだけ早い通路で低い通過数で線維芽細胞のストックを有し、細胞を変換する方が良い。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
過去にモデルに関する知識を共有してくれたヴィンセント・ムーリー博士に感謝したいと思います。この研究は、米国国立衛生研究所神経障害・脳卒中研究所(R01 NS043264(K.M.F.、 R.B W.))、米国国立国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所(NIAMS)(P50 AR070604-01(K.M.F.、K.M、R.N.、N.W.)。N.W.は、オハイオ州立大学/全国小児病院マッスルグループとフィリップ財団からフェローシップサポートを受けています。この作品はまた、内部の裁量資金によってサポートされ、エキソン2スキップ作業の一部は、CureDuchenne(K.M.F.)とアソシエーションフランセーズコントレミオパシーによってもサポートされています。IRB 番号: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 および IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
Referencias
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