תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות
Summary
פרוטוקול זה מתאר את ההמרה של פיברובלסטים בעור לתוך myoblasts ואת הבידול שלהם myotubes. קווי התאים נגזרים מחולים עם הפרעות נוירומוסקולריות וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מנגנונים פתולוגיים ולבדוק אסטרטגיות טיפוליות.
Abstract
חקירות הן של הפתופיזיולוגיה והן של המטרות הטיפוליות בדיסטרופיות שרירים נבלמו על ידי היכולת המרובית המוגבלת של מיובלסטים אנושיים. מספר מודלים של עכברים נוצרו אך הם אינם מייצגים באמת את הפיזיופתולוגיה האנושית של המחלה או שאינם מייצגים את הספקטרום הרחב של מוטציות שנמצאו בבני אדם. הנצחת המיובלסטים העיקריים האנושיים היא חלופה למגבלה זו; עם זאת, הוא עדיין תלוי ביופסיות שרירים, אשר פולשניים ולא זמין בקלות. לעומת זאת, ביופסיות עור קלות יותר להשגה ופחות פולשניות לחולים. פיברובלסטים המופקים מביופסיות עור ניתן להנציח ולהשתנות לתוך myoblasts, מתן מקור של תאים עם פוטנציאל מיוגני מעולה. כאן, אנו מתארים שיטת תכנות מחדש מהירה וישירה של פיברובלסט לשושלת מיוגנית. Fibroblasts הם transduced עם שני lentiviruses: hTERT כדי להנציח את התרבות העיקרית ואת MYODפטיש, אשר על תוספת של דוקסיציקלין, גורם ההמרה של fibroblasts לתוך myoblasts ולאחר מכן myotubes בוגרת, אשר מבטאים סמני בידול מאוחר. פרוטוקול transdifferentiation מהיר זה מייצג כלי רב עוצמה לחקור מנגנונים פתולוגיים ולחקור ביותרפיות חדשניות מבוססות גנים או תרופתיות להפרעות נוירומוסקולריות.
Introduction
מודלים תאיים המתקבלים ישירות מרקמות אנושיות שימושיים למודל של הפרעות גנטיות אנושיות רבות, עם היתרון של ההקשר הגנומי המקורי, ובמקרים רבים, שחזור אותם סימני היכר מולקולריים ותאית שנצפו בחולים. בתחום הפרעות נוירומוסקולריות, ביופסיות שרירים היו מקור נהדר למיובלסטים אנושיים ועזרו בהבהרה של מנגנונים פתולוגיים. בנוסף, הם כלי חשוב עבור בדיקות vivo של תרופות וטיפולים גנטיים. מצד אחד, הנגזרת של מיובלסטים משברי שרירים היא קלה יחסית. מצד שני, התרבות והתחזוקה של myoblasts העיקרי הם מאתגרים, בגלל שיעור התפשטות מוגבל שלהם ו senescence משכפל במבחנה1. חלופה למגבלות אלה היא להנציח מיובלסטים עם החדרת הטלומראז האנושי(hTERT)ו / או קינאז תלוי ציקלין 4 (CDK4)גנים 2,3, עם שימור של תכונות שריר השלד4. עם זאת, העקשנות של myoblasts העיקרי עדיין תלוי ביופסיה שרירים, הליך כירורגי עם חסרונות לחולים, אשר, במקרים רבים, יש את השרירים שלהם ניוון מתקדם. לכן, השריר של חולים אלה מורכב מחלק משמעותי של רקמת פיברוטית ו / או שומן ומניב פחות תאי שריר, הדורשים טיהור של התאים בעבר להנצחה.
בניגוד לביופסיות שרירים, ביופסיות עור נגישות יותר ופחות מזיקות לחולים. פיברובלסטים ראשוניים יכולים להיגזר משברי עור במבחנה. למרות fibroblasts אינם מושפעים בעיקר על ידי מוטציות הגורמות הפרעות neuromuscular, הם יכולים להיות transdifferentiated לתוך myoblasts. זה יכול להיות מושגת על ידי החדרת הגן Myod, גורם שעתוק רגולטורי מיוגני5. בכתב יד זה, אנו מתארים את הפרוטוקול להשגת מיובלסטים מופרכים, מהקמת תרבויות פיברובלסטים ועד נטיה של מיוטובים מובחנים (סיכום מייצג של השיטה מתואר באיור 1).
בדיקות פרה-קליניות של אסטרטגיות טיפוליות תלויות במודלים תאיים ובעלי חיים הנושאים מוטציות דומות למוטציות שנמצאו בחולים אנושיים. למרות הפיתוח של מודלים בעלי חיים הפך ריאלי יותר עם התקדמות של טכנולוגיות עריכת גנים כגון CRISPR / Cas96, זה עדיין מאתגר ויקר. לכן, קווי תאים שמקורם בחולה הם אופציה נגישה יש מודלים, המכסה את הספקטרום הגדול של מוטציות של מחלות כגון ניוון שרירים דושן (DMD). Obtention ויצירת מודלים של תאים חיוניים לפיתוח טיפולים מותאמים אישית עבור פתולוגיות כאלה.
בין טיפולים מותאמים אישית שנחקרו, exon דילוג אסטרטגיות הוא אחד המבטיחים עבור dystrophies שרירים שונים7,8. אסטרטגיה זו מורכבת מייצור חלבון קצר יותר אך פונקציונלי. זה מבוצע על ידי הסתרת ההגדרה exon לשחבור, ולכן להוציא את האקסון מוטציה מהשליח הסופי. זוהי טכנולוגיה מבטיחה מאוד שאושרה על ידי ה-FDA עבור DMD. לכן, אנו מתארים גם בפרוטוקול זה, שיטות כדי transfect myoblasts עם שתי exon שונים דילוג על טכנולוגיות קשורות: אוליגונוקלאוטידים antisense (AON) ו U7snRNA-אדנו הקשורים וירוס (AAV). AON transfection הוא כלי טוב עבור ההקרנה הראשונית של מספר רצפים שנועדו לקדם אקסון דילוג9. עם זאת, הפעילות של AONs היא חולפת. כדי לקבל ביטוי מתמשך של רצפי antisense, חקרנו גם RNAs גרעיניים קטנים (snRNAs) בשילוב עם AAV, המאפשר לוקליזציה גרעינית והכללה במכונות השחבור10. U7 הוא snRNA מעורב בעיבוד של mRNA histone שניתן להנדס כדי לאגד חלבונים כי יהיה להפנות אותו לשחבור ולספק רצפי antisense11. השימוש ב- U7 snRNAs שונה בשילוב עם וקטורים AAV מתגבר על מגבלות של AONs וכתוצאה מכך ביטוי מתמשך של AONs והעברה טובה יותר של רקמות שלעניין 12. אנו משתמשים בתאים הנגזרים מחולים DMD עבור פרוטוקול זה כדי להמחיש את אסטרטגיית דילוג exon.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להשיג קווי תא FM באיכות טובה, כמה צעדים הם קריטיים. ככל שביופסיה של העור מעובדת מוקדם יותר, כך גדלים הסיכויים להשיג פיברובלסטים בריאים. מספר המעבר של תרבויות פיברובלסטים חשוב גם הוא. לתאים ראשיים יש יכולת התפשטות מוגבלת ולאחר מעברים רבים, הם נכנסים בהיגיון משכפל. לכן, עדיף שיש מלאי של fibrob…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר וינסנט מולי על ששיתף את הידע שלו בעבר בנוגע למודל. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה”ב המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (R01 NS043264 (K.M.F., ו R.B.W.)), המכונים הלאומיים לבריאות בארה”ב המכון הלאומי של דלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., ו N.W.). N.W. קיבל תמיכה מלגות מאוניברסיטת אוהיו סטייט / ארצית בית החולים לילדים שריר הקבוצה ואת קרן פיליפ. עבודה זו נתמכה גם על ידי קרנות פנימיות לפי שיקול דעת וחלק מעבודת הדילוג exon 2 נתמכה גם על ידי CureDuchenne (K.M.F.) והאיגוד הצרפתי קונטר לס מיופתיות. מספר IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 ו- IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
Referencias
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
- Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
- Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43 (2016).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
- Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5 (2019).
- Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
- De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
- Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
- Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
- Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Biología del desarrollo. 265 (2), 294-301 (2004).
