تقييم غير مدمر لكثافة الخلايا الإقليمية داخل مجاميع الورم بعد العلاج بالعقاقير
Summary
يطور البروتوكول الحالي تقنية قائمة على الصور لقياس كثافة الخلايا الإقليمية السريعة وغير المدمرة والخالية من الملصقات وقابلية البقاء داخل مجاميع الأورام 3D. كشفت النتائج عن تدرج كثافة الخلايا، مع كثافات خلايا أعلى في المناطق الأساسية من الطبقات الخارجية في المجاميع النامية وموت الخلايا الطرفية في الغالب في مجاميع HER2+ المعالجة باستخدام Trastuzumab.
Abstract
أظهرت نماذج الورم الكروي متعدد الخلايا (MCTSs) فائدة متزايدة للدراسة في المختبر لتطور السرطان واكتشاف الأدوية. هذه التركيبات اللاوعائية البسيطة نسبيا تحاكي الجوانب الرئيسية للأورام في الجسم الحي ، مثل بنية 3D والتدرجات الفسيولوجية المرضية. يمكن أن توفر نماذج MCTSs رؤى ثاقبة حول سلوك الخلايا السرطانية أثناء التطور الكروي واستجابة للعقاقير. ومع ذلك ، فإن حجمها المطلوب يحد بشكل كبير من الأدوات المستخدمة في التقييم غير المدمر. يتم استكشاف التصوير الهيكلي للتصوير المقطعي بالتماسك البصري وبرنامج تحليل Imaris 3D لقياس سريع وغير مدمر وخالي من الملصقات لكثافة الخلايا الإقليمية داخل MCTSs. يستخدم هذا النهج لتقييم MCTSs على مدى فترة نضج مدتها 4 أيام وطوال فترة علاج ممتدة لمدة 5 أيام باستخدام Trastuzumab ، وهو دواء مضاد ل HER2 ذي صلة سريريا. باختصار ، تم إنشاء AU565 HER2 + سرطان الثدي MCTSs عن طريق تراكب السائل مع أو بدون إضافة Matrigel (مصفوفة غشاء قبوي) لاستكشاف مجاميع من مورفولوجيات مختلفة (أكثر سمكا ، مثل القرص 2.5D المجاميع أو المجاميع 2D مسطحة ، على التوالي). تميزت كثافة الخلايا داخل المنطقة الخارجية والمنطقة الانتقالية والنواة الداخلية في MCTSs الناضجة ، مما كشف عن تدرج كثافة الخلايا مع كثافات خلوية أعلى في المناطق الأساسية مقارنة بالطبقات الخارجية. أعادت إضافة المصفوفة توزيع كثافة الخلايا وعززت هذا التدرج ، مما قلل من كثافة المنطقة الخارجية وزاد من ضغط الخلايا في النوى. تم قياس كثافة الخلايا كميا بعد العلاج من تعاطي المخدرات (0 ساعة ، 24 ساعة ، 5 أيام) داخل مناطق أعمق تدريجيا 100 ميكرومتر لتقييم الاختلافات الإقليمية المحتملة في الاستجابة للعقاقير. وبحلول النقطة الزمنية الأخيرة، بدا أن جميع وفيات الخلايا تقريبا مقيدة ب 200 ميكرومتر من كل مجموعة، في حين بدت الخلايا الأعمق في المجموع غير متأثرة إلى حد كبير، مما يوضح الاختلافات الإقليمية في الاستجابة للدواء، ربما بسبب القيود المفروضة على تغلغل المخدرات. يوفر البروتوكول الحالي تقنية فريدة من نوعها لتحديد كثافة الخلايا الإقليمية داخل الأنسجة الخلوية الكثيفة بشكل غير مدمر وقياسها طوليا.
Introduction
تحول الباحثون إلى حد كبير إلى ثقافة 3D على مقاعد البدلاء في الأنظمة المختبرية لدراسة بعض السمات الرئيسية لتطور الورم. وقد قاد الكثير من هذا البحث من خلال عودة ظهور الأورام الكروية متعددة الخلايا (MCTSs) والمواد العضوية الأكثر تعقيدا 1,2. على الرغم من أن هذه النماذج هي الأوعية الدموية ، إلا أنها توفر أداة قوية لتلخيص العمليات الفسيولوجية والمرضية التي تحدث في الجسم الحي3،4،5. على وجه الخصوص ، يمكن للنماذج متوسطة الحجم (قطرها 300-500 ميكرومتر) محاكاة ميزات الورم الرئيسية مثل بنية 3D ، والتدرجات الفسيولوجية المرضية ، والإشارات النقيلية بسبب نقص الأكسجة داخل القلب. من الموثق جيدا أن هذه النماذج تعرض الطبقات متحدة المركز المميزة التي شوهدت في أورام الأوعية الدموية في الجسم الحي ، وهي طبقة خارجية من الخلايا التكاثرية ، وطبقة انتقالية من الخلايا الشائخة / الهادئة ، والخلايا التي تعاني من نقص الأكسجة في القلب3،6،7،8،9 . يمكن الحصول على رؤية فريدة من نوعها من هذه النماذج من خلال توصيف سلوك الخلايا داخل هذه الطبقات ، أثناء التطوير والاستجابة للدواء. ومع ذلك ، فإن حجم MCTS المطلوب ، الضروري لتطوير التدرجات التي تجعلها قوية في النماذج المختبرية ، يحد بشكل كبير من الأدوات المستخدمة في التقييم غير المدمر. والواقع أن أحد أكبر التحديات التي تواجه التحليل غير المدمر للمركبات المتوسطة الأجل يتمثل في تحديد التفاصيل على نطاق الخلايا. يتم استخدام المجهر الساطع المجال وتباين الطور بشكل روتيني لتقييم نمو وتطوير 3D MCTSs بشكل غير مدمر. ومع ذلك ، تقتصر هذه الطرائق على إسقاطات ثنائية الأبعاد ، تفتقر إلى القدرة على تصور الهيكل ثلاثي الأبعاد الحاسم لهذه النماذج10،11،12،13. عادة ما يتم جمع المعلومات حول السمية الخلوية وتكاثر الخلايا من خلال التصوير الفلوري (أي المجهر الضوئي ، المجهر البؤري) أو التلطيخ المناعي خارج الجسم الحي 14،15،16. في حين أن هذه الأساليب توفر معلومات قيمة وعالية الدقة عن بنية الأنسجة والكثافة الخلوية والوظيفة الخلوية ، فإنها غالبا ما تتطلب إعداد عينات مثل التطهير البصري أو التثبيت / التلطيخ أو التضمين الذي يمنع التحليلات الطولية.
التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) هو طريقة تصوير هيكلي غير مدمرة لديها القدرة على التغلب على بعض التحديات المذكورة أعلاه. إنه يتميز بدقة خلوية ومجال رؤية واسع بما فيه الكفاية (يصل إلى 10 مم × 10 مم) قادر على تصور المجاميع متعددة الخلايا بالكامل17،18،19. الأهم من ذلك ، نظرا للطبيعة المرئية للضوء المستخدم ، فإن هذه التقنية غير مدمرة تماما وخالية من الملصقات17. أيضا ، يمكن تصوير العينات في الموقع دون الحاجة إلى إعداد العينات ، بحيث يمكن أخذ العينات مباشرة من الحاضنة ، ومسحها ضوئيا بسرعة باستخدام OCT (مدة المسح ~ 5-10 دقائق) ، ثم إعادتها إلى الحاضنة ، مما يتيح التوصيف الطولي. ظهرت مؤخرا العديد من الدراسات التي تسعى إلى استخدام OCT لتحليل السلوك الكروي للورم. في واحدة من أكثر العروض إثارة ، استخدم هوانغ وآخرون OCT للكشف عن النوى الميتة بشكل غير مدمر داخل النماذج الكروية الكبيرة للورم ، مع ملاحظة أن مناطق الخلايا الحية والميتة تمتلك اختلافات ملحوظة في التوهين البصري ، والتي يمكن استخدامها لمراقبة الجدوى الخالية من الملصقات20. وبالمثل ، أجرى هاري وآخرون قياسات معامل الانكسار (RI) لسرطان القولون البشري (HCT116) الكروية التي تم تصويرها باستخدام OCT لدراسة وجود نقص الأكسجة داخل العينات21. لم تكن قياساتهم كافية للاستدلالات المباشرة ، على الرغم من أنهم لاحظوا انخفاض المثيل المحجوز في المواقع التي ترتبط بالموقع ، وإن لم يكن الحجم ، للنوى الميتة ، والتي تم تحديدها لاحقا عن طريق المجهر البؤري. استخدم عبد الصادق وآخرون OCT لتصور وقياس جدوى الأنسجة الإقليمية لنماذج أورام سرطان الثدي22. أبلغوا عن طريقتين قائمتين على OCT لتصور ديناميكيات الأنسجة وأظهروا علاقة معتدلة بين الاختلافات في هذه المقاييس والمناطق المحددة بالفحص المجهري للخلايا الحية / الميتة.
عملنا المنشور باستخدام OCT مبني على هذه الأدبيات السابقة لإنشاء نهج كمي وغير مدمر لقياس مورفولوجيا 3D وعدد الخلايا داخل نماذج سرطان الثدي MCTSs أثناء التطوير10,23. باستخدام برنامج تحليل الصور Imaris 3D لحساب عدد الكائنات بحجم الخلية (أي البقع) التي تم تصويرها ضمن عمليات مسح حجم OCT ، تم قياس عدد الخلايا بشكل غير مدمر في MCTSs التي كانت مشابهة إحصائيا لتلك التي تم تحديدها عبر مقياس الدم عند الانفصال الكلي. ومع ذلك ، نظرا للطبيعة الهيكلية ل OCT ، فإن أغشية الخلايا التي لا تزال موجودة بعد موت الخلايا عن طريق النخر قد تحسب خطأ على أنها خلايا حية. وعلاوة على ذلك، تم توسيع نطاق هذا التوصيف ليشمل بقاء الخلايا غير المدمرة داخل المجاميع الفردية الخاضعة لنظام دوائي مع نجاح واعد10. الأهم من ذلك ، لوحظ أنه تم الإبلاغ عن صلاحية خلية مماثلة من نهجنا OCT-Imaris مع ما تم قياسه داخل هذه العينات عند الانفصال. يتيح نهج الخلايا غير المدمر والخالي من الملصقات حساب الخلايا داخل هياكل 3D والمجاميع الكثيفة طوليا دون التضحية ببنية البناء / الركام.
يشير هذا العمل إلى نهج محسن لتحديد كثافة الخلايا الإقليمية مباشرة داخل المجاميع الكثيفة من خلال الاستفادة من قدرة OCT-Imaris على قياس كل من مورفولوجيا المجموع 3D وعدد الخلايا. يوفر هذا التقدم المنهجي صورة أكثر تفصيلا للتوزيع المكاني للخلايا وانتشارها داخل الطبقات متحدة المركز المميزة لنماذج MCTSs. بدلا من مجرد حساب المتوسط الكلي لكثافة الخلايا الكلية ، يمكن أن تكشف قياسات الكثافة المحلية هذه عن تدرجات كثافة الخلية ، مثل تلك المرتبطة بالضغط. ويطبق هذا التقييم الإقليمي أيضا على المجاميع المعالجة بالعلاج الكيميائي لتقييم الاستجابة الإقليمية للأدوية، كما تقاس بالتغيرات في كثافة الخلايا المحلية. يوفر هذا المزيج من OCT وطرق تحليل التصوير المتقدمة تقديرا كميا لصلاحية الخلايا الإقليمية ، والتي يمكن استخدامها لاستكشاف تغلغل الدواء بناء على المناطق التي تشهد انخفاضا في كثافة الخلايا. هذا هو التقرير الأول الذي يحدد بشكل غير مدمر كثافة الخلايا الإقليمية وقابليتها للحياة استجابة للدواء داخل الأنسجة الخلوية الكثيفة وقياسه طوليا. مثل هذا التوصيف لكثافة الخلايا ثلاثية الأبعاد والتوزيع المكاني في جميع أنحاء MCTSs بأكملها قد يساعد في تحسين توصيل الأدوية في علاج السرطان وتحسين فهم تطور نموذج السرطان.
Protocol
Representative Results
Discussion
اهميه
الكرويات الورم متعدد الخلايا (MCTSs) هي نماذج قوية ثلاثية الأبعاد في المختبر لدراسة تطور الورم وفحص المخدرات1،2،3. يعتمد تطوير فائدة هذه النماذج الإجمالية البسيطة نسبيا بشكل كبير على توصيف سماتها الرئيسية ، مثل التشكل ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل NIH R01 BRG CA207725 (MB / DTC) و NIH R01 CA233188 (MB). نود أن نشكر صيدلية AMC على Trastuzumab المقدمة لهذه التجارب.
Materials
| 96 well plates | Greiner Bio-One | 650970 | CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/ |
| 0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| AU565 breast cancer cells | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| FIJI software | open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267151B | |
| Imaris image analysis software | Bitplane | Current version 9.8 | |
| L-glutamine | Lonza | 17-605E | |
| Matrigel | Corning | 354263 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | ||
| Microscope | Zeiss | Z1 AxioVision | |
| Penicilin streptomycin | Corning | 30-0002CI | |
| Plate centrifuge | Eppendorf | ||
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| Spectral Domain Optical Coherence Tomography | ThorLabs | TEL220C1 | |
| T75 cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Trastuzumab | Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy. |
Referencias
- Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
- Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Investigación sobre el cáncer. 46 (7), 3504-3512 (1986).
- Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
- Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
- Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
- Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
- Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
- Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
- Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
- Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Investigación sobre el cáncer. 77 (21), 6011-6020 (2017).
- Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844 (2021).
- Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
- Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
- Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947 (2013).
- Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102 (2017).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
- Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124 (2014).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760 (2021).
- . High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015)
- Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
- Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).
