Avaliação não destrutiva da densidade celular regional dentro dos agregados tumorais após o tratamento medicamentoso

Summary

O presente protocolo desenvolve uma técnica baseada em imagem para a densidade celular regional rápida, não destrutiva e livre de rótulos e a medição da viabilidade dentro dos agregados tumorais 3D. Os achados revelaram um gradiente de densidade celular, com densidades celulares mais altas em regiões centrais do que camadas externas no desenvolvimento de agregados e morte celular predominantemente periférica em agregados HER2+ tratados com Trastuzumab.

Abstract

Modelos de spheroids tumores multicelulares (MCTSs) têm demonstrado utilidade crescente para o estudo in vitro da progressão do câncer e descoberta de medicamentos. Esses construtos avasculares relativamente simples imitam aspectos-chave de tumores in vivo , como estrutura 3D e gradientes fisiodológicos. Os modelos mctss podem fornecer insights sobre o comportamento das células cancerosas durante o desenvolvimento de esferoides e em resposta a drogas; no entanto, seu tamanho necessário limita drasticamente as ferramentas utilizadas para avaliação não destrutiva. As imagens estruturais de tomografia de Coerência Óptica e o software de análise 3D Imaris são explorados para medição rápida, não destrutiva e livre de rótulos da densidade celular regional dentro dos MCTSs. Esta abordagem é utilizada para avaliar os MCTSs durante um período de maturação de 4 dias e durante um tratamento prolongado de 5 dias com Trastuzumab, um medicamento anti-HER2 clinicamente relevante. Resumidamente, os MCTSs de câncer de mama AU565 HER2+ foram criados por sobreposição líquida com ou sem a adição de Matrigel (uma matriz de membrana de porão) para explorar agregados de diferentes morfologias (agregados 2.5D mais espessos, semelhantes a discos ou agregados 2D planos, respectivamente). A densidade celular dentro da região externa, região transitória e núcleo interno foi caracterizada em MCTSs amadurecidos, revelando um gradiente de densidade celular com maiores densidades celulares em regiões centrais em comparação com camadas externas. A adição matricial redistribuiu a densidade celular e aumentou esse gradiente, diminuindo a densidade da zona externa e aumentando a compactação celular nos núcleos. A densidade celular foi quantificada após o tratamento medicamentoso (0h, 24 h, 5 dias) dentro de zonas progressivamente mais profundas de 100 μm para avaliar potenciais diferenças regionais na resposta a medicamentos. No ponto de tempo final, quase todas as mortes celulares pareciam estar restritas aos 200 μm externos de cada agregado, enquanto as células mais profundas no agregado pareciam em grande parte não afetadas, ilustrando diferenças regionais na resposta à droga, possivelmente devido a limitações na penetração de drogas. O protocolo atual fornece uma técnica única para quantificar involuntariamente a densidade celular regional dentro de tecidos celulares densos e medi-la longitudinalmente.

Introduction

Pesquisadores têm se voltado em grande parte para a cultura 3D benchtop sistemas in vitro para estudar algumas das principais características da progressão do tumor. Grande parte desta pesquisa tem sido liderada pelo ressurgimento de esferoides multicelulares tumorais (MCTSs) e organoides mais complexos ^1,2. Embora esses modelos sejam avasculares, eles fornecem uma poderosa ferramenta para recapitulação de processos fisiológicos e patológicos que ocorrem in vivo ^3,4,5. Em particular, modelos de tamanho médio (300-500 μm de diâmetro) podem imitar características principais do tumor, como estrutura 3D, gradientes fisiopatológicos e sinalização metastática devido à hipóxia dentro do núcleo. Está bem documentado que esses modelos exibem as camadas concêntricas características vistas em tumores in vivo vascularizados, ou seja, uma camada externa de células proliferativas, uma camada transitória de células senescentes/quiescentes, e células que experimentam hipóxia no núcleo 3,6,7,8,9 . Uma visão única pode ser obtida a partir desses modelos caracterizando o comportamento celular dentro dessas camadas, durante o desenvolvimento e em resposta à droga. No entanto, o tamanho necessário do MCTS, necessário para desenvolver os gradientes que os tornam tão poderosos modelos in vitro, limita drasticamente as ferramentas usadas para avaliação não destrutiva. De fato, um dos maiores desafios com a análise não destrutiva dos MTCSs é quantificar detalhes em escala celular. A microscopia de campo brilhante e de contraste de fase são rotineiramente utilizadas para avaliar o crescimento e o desenvolvimento de MCTSs 3D de forma não destrutiva. No entanto, essas modalidades estão limitadas a projeções 2D, sem capacidade de visualização da estrutura 3D crucial desses modelos 10,11,12,13. Informações sobre citotoxicidade e proliferação celular são tipicamente coletadas através de imagens fluorescentes (ou seja, microscopia de folha de luz, microscopia confocal) ou coloração imunohistológica ex vivo 14,15,16. Embora essas abordagens forneçam informações valiosas e de alta resolução sobre estrutura tecidual, densidade celular e função celular, muitas vezes requerem preparação de amostras, como limpeza óptica, fixação/coloração ou incorporação que previne análises longitudinais.

A Tomografia Óptica coerência (OCT) é uma modalidade de imagem estrutural não destrutiva que tem potencial para superar alguns dos desafios mencionados acima. Possui resolução celular e um campo de visão suficientemente amplo (até 10 mm x 10 mm) capaz de visualizar agregados multicelulares inteiros 17,18,19. É importante ressaltar que, devido à natureza visível da luz utilizada, esta técnica é completamente não destrutiva e livre de rótulos¹⁷. Além disso, as amostras podem ser imagens in situ sem exigir a preparação da amostra, de modo que as amostras podem ser retiradas diretamente da incubadora, rapidamente escaneadas com OCT (duração de varredura ~5-10 min), e depois devolvidas à incubadora, permitindo a caracterização longitudinal. Muitos estudos que buscam usar o OCT para analisar o comportamento esferoide tumoral surgiram recentemente. Em uma das demonstrações mais emocionantes, Huang et al. usaram o OCT para detectar de forma não destrutiva núcleos necroses dentro de grandes modelos de esferoides tumorais, observando que regiões de células vivas e mortas possuem diferenças perceptíveis na atenuação óptica, que podem ser utilizadas para o monitoramento de viabilidade sem^{rótulos 20}. Da mesma forma, Hari et al. realizaram medições de índice refrativo (RI) de esferoides de câncer de cólon humano (HCT116) imagens com OCT para estudar a presença de hipóxia dentro das amostras²¹. Suas medidas não foram suficientes para inferências diretas, embora tenham observado menor RI em locais que se correlacionavam com o local, embora não tamanho, de núcleos necrosados, posteriormente identificados via microscopia confocal. Abd El-Sadek et al. usaram o OCT para visualizar e quantificar a viabilidade do tecido regional dos modelos de tumor de câncer de mama²². Eles relataram dois métodos baseados em OCT para visualizar a dinâmica tecidual e mostraram uma correlação moderada entre diferenças nessas métricas e regiões identificadas por microscopia de células vivas/mortas.

Nosso trabalho publicado usando o OCT baseou-se nesta literatura anterior para estabelecer uma abordagem quantitativa e não destrutiva para medir a morfologia 3D e a contagem de células dentro dos modelos de câncer de mama mctss durante o desenvolvimento^10,23. Usando o software de análise de imagem de renderização 3D Imaris para contar o número de objetos do tamanho de células (ou seja, manchas) visualizados dentro dos volumes de OCT, as contagens de células foram medidas não destrutivamente em MCTSs estatisticamente semelhantes aos determinados via hemocitômetro após dissociação agregada. No entanto, devido à natureza estrutural do OCT, as membranas celulares ainda presentes após a morte celular por necrose podem ser erroneamente contadas como células vivas. Além disso, essa caracterização foi estendida à viabilidade celular não destrutiva dentro de agregados individuais submetidos a um regime de drogas com sucesso promissor¹⁰. É importante ressaltar que a viabilidade celular semelhante foi relatada a partir da nossa abordagem OCT-Imaris com o que foi benchmarked dentro dessas amostras após a dissociação. Essa abordagem celular não destrutiva e livre de rótulos permite que as células sejam contadas dentro de construtos 3D e agregados densos longitudinalmente sem sacrificar a estrutura de construção/agregado.

O presente trabalho relata uma abordagem melhorada para quantificar diretamente a densidade celular regional dentro de agregados densos, aproveitando a capacidade dos OCT-Imaris de medir tanto a morfologia agregada 3D quanto o número celular. Esse avanço metodológico fornece um quadro mais detalhado da distribuição espacial e proliferação das células dentro das camadas concêntricas características dos modelos MCTSs. Em vez de simplesmente calcular uma densidade celular agregada média global, tais medidas de densidade local podem revelar gradientes de densidade celular, como aqueles associados à compactação. Esta avaliação regional também é aplicada a agregados tratados com quimioterapia para avaliar a resposta regional de medicamentos, medida por mudanças na densidade celular local. Essa combinação de OCT e métodos avançados de análise de imagens fornecem quantificação da viabilidade celular regional, que pode ser usada para explorar a penetração de medicamentos com base em quais regiões experimentam diminuição na densidade celular. Este é o primeiro relatório para quantificar de forma não destrutiva a densidade celular regional e a viabilidade em resposta à droga dentro de tecidos celulares densos e medi-la longitudinalmente. Tal caracterização da densidade celular tridimensional e distribuição espacial em todo o MCTSs pode ajudar a otimizar o fornecimento de medicamentos no tratamento do câncer e melhorar a compreensão da progressão do modelo de câncer.

Protocol

Foram utilizadas linhas de células cancerígenas de mama AU565 (HER2+) e MDA-MB-231 para o presente estudo (ver Tabela de Materiais). 1. Preparação de agregados tumorais Prepare a mídia de crescimento de células cancerígenas de mama AU565 (HER2+) usando o Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 basal medium (+) em L-glutamina suplementada com 10% (v/v) soro bovino fetal e 1% penicilina/estreptomicina (ver Tabela de Materiais</strong…

Representative Results

Em uma publicação anterior, foi estabelecido um método para a medição não destrutiva da densidade celular global dentro de agregados celulares usando10 de outubro. Aqui, essa técnica é estendida para avaliar a densidade celular regional dos agregados celulares em desenvolvimento. A Figura 1 mostra um esquema desta extensão, onde a densidade celular pode ser avaliada em camadas concêntricas de um esfóide ou mais localmente olhando em vez disso para pequenos …

Discussion

Significado
Os spheróides tumorais multicelulares (MCTSs) são poderosos modelos in vitro 3D para estudar a progressão do tumor e o rastreamento de medicamentos ^1,2,3. O avanço da utilidade desses modelos agregados relativamente simples depende fortemente da caracterização de suas características-chave, como morfologia e densidade celular, que são conhecidas por influenciar tanto a progressão…

Materials

96 well plates	Greiner Bio-One	650970	CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
AU565 breast cancer cells	ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
FIJI software	open-source	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267151B
Imaris image analysis software	Bitplane		Current version 9.8
L-glutamine	Lonza	17-605E
Matrigel	Corning	354263
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC
Microscope	Zeiss	Z1 AxioVision
Penicilin streptomycin	Corning	30-0002CI
Plate centrifuge	Eppendorf
RPMI medium 1640	Gibco	11875-085
Spectral Domain Optical Coherence Tomography	ThorLabs	TEL220C1
T75 cell culture flasks	Greiner Bio-One	658175
Trastuzumab			Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy.