Evaluación no destructiva de la densidad celular regional dentro de los agregados tumorales después del tratamiento farmacológico

Summary

El presente protocolo desarrolla una técnica basada en imágenes para la medición rápida, no destructiva y libre de etiquetas de la densidad celular regional y la viabilidad dentro de agregados tumorales 3D. Los hallazgos revelaron un gradiente de densidad celular, con densidades celulares más altas en las regiones centrales que en las capas externas en los agregados en desarrollo y predominantemente muerte celular periférica en agregados HER2+ tratados con Trastuzumab.

Abstract

Los modelos de esferoides tumorales multicelulares (MCTS) han demostrado una utilidad cada vez mayor para el estudio in vitro de la progresión del cáncer y el descubrimiento de fármacos. Estas construcciones avasculares relativamente simples imitan aspectos clave de los tumores in vivo , como la estructura 3D y los gradientes fisiopatológicos. Los modelos MCTS pueden proporcionar información sobre el comportamiento de las células cancerosas durante el desarrollo de esferoides y en respuesta a los medicamentos; sin embargo, su tamaño requerido limita drásticamente las herramientas utilizadas para la evaluación no destructiva. Se exploran imágenes estructurales de tomografía de coherencia óptica y software de análisis 3D Imaris para la medición rápida, no destructiva y sin etiquetas de la densidad celular regional dentro de los MCTS. Este enfoque se utiliza para evaluar los MCTS durante un período de maduración de 4 días y durante un tratamiento prolongado de 5 días con Trastuzumab, un fármaco anti-HER2 clínicamente relevante. Brevemente, los MCTS de cáncer de mama AU565 HER2+ se crearon a través de una superposición líquida con o sin la adición de Matrigel (una matriz de membrana basal) para explorar agregados de diferentes morfologías (agregados 2.5D más gruesos, similares a discos o agregados 2D planos, respectivamente). La densidad celular dentro de la región externa, la región de transición y el núcleo interno se caracterizó en los MCTS maduros, revelando un gradiente de densidad celular con densidades celulares más altas en las regiones centrales en comparación con las capas externas. La adición de la matriz redistribuyó la densidad celular y mejoró este gradiente, disminuyendo la densidad de la zona externa y aumentando la compactación celular en los núcleos. La densidad celular se cuantificó después del tratamiento farmacológico (0 h, 24 h, 5 días) dentro de zonas progresivamente más profundas de 100 μm para evaluar las posibles diferencias regionales en la respuesta al fármaco. En el punto de tiempo final, casi toda la muerte celular parecía estar limitada a los 200 μm externos de cada agregado, mientras que las células más profundas en el agregado parecían en gran medida no afectadas, lo que ilustra las diferencias regionales en la respuesta al fármaco, posiblemente debido a limitaciones en la penetración del fármaco. El protocolo actual proporciona una técnica única para cuantificar de forma no destructiva la densidad celular regional dentro de tejidos celulares densos y medirla longitudinalmente.

Introduction

Los investigadores han recurrido en gran medida a los sistemas in vitro de cultivo 3D de sobremesa para estudiar algunas de las características clave de la progresión tumoral. Gran parte de esta investigación ha sido liderada por la reaparición de esferoides tumorales multicelulares (MCTS) y organoides más complejos ^1,2. Aunque estos modelos son avasculares, proporcionan una poderosa herramienta para recapitular los procesos fisiológicos y patológicos que ocurren in vivo ^3,4,5. En particular, los modelos de tamaño mediano (300-500 μm de diámetro) pueden imitar características clave del tumor, como la estructura 3D, los gradientes fisiopatológicos y la señalización metastásica debido a la hipoxia dentro del núcleo. Está bien documentado que estos modelos muestran las capas concéntricas características observadas en tumores vascularizados in vivo, a saber, una capa externa de células proliferativas, una capa de transición de células senescentes / quiescentes y células que experimentan hipoxia en el núcleo 3,6,7,8,9 . Se puede obtener una visión única de estos modelos al caracterizar el comportamiento celular dentro de estas capas, durante el desarrollo y en respuesta al medicamento. Sin embargo, el tamaño MCTS requerido, necesario para desarrollar los gradientes que los hacen tan potentes modelos in vitro, limita drásticamente las herramientas utilizadas para la evaluación no destructiva. De hecho, uno de los mayores desafíos con el análisis no destructivo de los MTCS es cuantificar los detalles a escala celular. La microscopía de campo brillante y de contraste de fase se utiliza rutinariamente para evaluar el crecimiento y desarrollo de los MCTS 3D de forma no destructiva. Sin embargo, estas modalidades se limitan a proyecciones 2D, careciendo de la capacidad de visualizar la estructura 3D crucial de estos modelos 10,11,12,13. La información sobre citotoxicidad y proliferación celular se recopila típicamente a través de imágenes fluorescentes (es decir, microscopía de lámina de luz, microscopía confocal) o tinción inmunohistológica ex vivo 14,15,16. Si bien estos enfoques proporcionan información valiosa y de alta resolución sobre la estructura del tejido, la densidad celular y la función celular, a menudo requieren la preparación de muestras, como la limpieza óptica, la fijación / tinción o la incrustación que impide los análisis longitudinales.

La tomografía de coherencia óptica (OCT) es una modalidad de imagen estructural no destructiva que tiene el potencial de superar algunos de los desafíos mencionados anteriormente. Cuenta con resolución celular y un campo de visión suficientemente amplio (hasta 10 mm x 10 mm) capaz de visualizar agregados multicelulares completos 17,18,19. Es importante destacar que, debido a la naturaleza visible de la luz utilizada, esta técnica es completamente no destructiva y libre de etiquetas¹⁷. Además, las muestras se pueden obtener imágenes in situ sin necesidad de preparación de muestras, de modo que las muestras se pueden tomar directamente de la incubadora, escanearse rápidamente con OCT (duración del escaneo ~ 5-10 min) y luego devolverse a la incubadora, lo que permite la caracterización longitudinal. Recientemente han surgido muchos estudios que buscan usar oct para analizar el comportamiento de los esferoides tumorales. En una de las demostraciones más emocionantes, Huang et al. utilizaron oct para detectar núcleos necróticos de forma no destructiva dentro de grandes modelos de esferoides tumorales, señalando que las regiones de células vivas y muertas poseen diferencias discernibles en la atenuación óptica, que pueden utilizarse para el monitoreo de viabilidad sin etiquetas²⁰. Del mismo modo, Hari et al. realizaron mediciones del índice de refracción (RI) de los esferoides del cáncer de colon humano (HCT116) fotografiados con OCT para estudiar la presencia de hipoxia en las muestras²¹. Sus mediciones no fueron suficientes para inferencias directas, aunque observaron una RI más baja en ubicaciones que se correlacionaban con el sitio, aunque no el tamaño, de los núcleos necróticos, identificados más tarde a través de microscopía confocal. Abd El-Sadek et al. utilizaron oct para visualizar y cuantificar la viabilidad tisular regional de los modelos tumorales de cáncer de mama²². Informaron dos métodos basados en OCT para visualizar la dinámica de los tejidos y mostraron una correlación moderada entre las diferencias en estas métricas y las regiones identificadas por microscopía de células vivas / muertas.

Nuestro trabajo publicado utilizando OCT se basó en esta literatura previa para establecer un enfoque cuantitativo y no destructivo para medir la morfología 3D y el recuento de células dentro de los modelos de cáncer de mama MCTS durante el desarrollo^10,23. Utilizando el software de análisis de imágenes de renderizado 3D Imaris para contar el número de objetos del tamaño de una célula (es decir, manchas) fotografiados dentro de los escaneos de volumen de OCT, los recuentos de células se midieron de manera no destructiva en MCTS que fueron estadísticamente similares a los determinados a través del hemocitómetro tras la disociación agregada. Sin embargo, debido a la naturaleza estructural de la OCT, las membranas celulares aún presentes después de la muerte celular por necrosis pueden contarse erróneamente como células vivas. Además, esta caracterización se extendió para rastrear de manera no destructiva la viabilidad celular dentro de agregados individuales sometidos a un régimen farmacológico con un éxito prometedor¹⁰. Es importante destacar que se observó que se informó una viabilidad celular similar a partir de nuestro enfoque OCT-Imaris con lo que se comparó dentro de estas muestras tras la disociación. Este enfoque celular no destructivo y libre de etiquetas permite que las células se cuenten dentro de construcciones 3D y agregados densos longitudinalmente sin sacrificar la estructura de construcción / agregado.

El presente trabajo informa de un enfoque mejorado para cuantificar directamente la densidad celular regional dentro de agregados densos aprovechando la capacidad de OCT-Imaris para medir tanto la morfología agregada 3D como el número de células. Este avance metodológico proporciona una imagen más detallada de la distribución espacial y la proliferación de las células dentro de las capas concéntricas características de los modelos MCTS. En lugar de simplemente calcular una densidad celular agregada promedio general, tales mediciones de densidad local pueden revelar gradientes de densidad celular, como los asociados con la compactación. Esta evaluación regional también se aplica a los agregados tratados con un quimioterapéutico para evaluar la respuesta regional al fármaco, medida por los cambios en la densidad celular local. Esta combinación de OCT y métodos avanzados de análisis de imágenes proporciona cuantificación de la viabilidad celular regional, que puede usarse para explorar la penetración del fármaco en función de qué regiones experimentan disminuciones en la densidad celular. Este es el primer informe para cuantificar de forma no destructiva la densidad celular regional y la viabilidad en respuesta al fármaco dentro de tejidos celulares densos y medirlo longitudinalmente. Dicha caracterización de la densidad celular tridimensional y la distribución espacial a lo largo de mcTS completos puede ayudar a optimizar la administración de fármacos en el tratamiento del cáncer y mejorar la comprensión de la progresión del modelo de cáncer.

Protocol

Para el presente estudio se utilizaron las líneas celulares de cáncer de mama AU565 (HER2+) y MDA-MB-231 (ver Tabla de Materiales). 1. Preparación de agregados tumorales Prepare los medios de crecimiento de células de cáncer de mama AU565 (HER2+) utilizando el medio basal (+) 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) en L-glutamina suplementada con suero bovino fetal al 10% (v/v) y penicilina/estreptomicina al 1% (ver Tabla de mate…

Representative Results

En una publicación anterior, se estableció un método para la medición no destructiva de la densidad celular global dentro de agregados celulares utilizando OCT10. Aquí, esta técnica se extiende para evaluar la densidad celular regional de los agregados celulares en desarrollo. La Figura 1 muestra un esquema de esta extensión, donde la densidad celular se puede evaluar en capas concéntricas de un esferoide o más localmente mirando en su lugar pequeños tapones…

Discussion

Importancia
Los esferoides tumorales multicelulares (MCTS) son potentes modelos 3D in vitro para estudiar la progresión tumoral y el cribado^{farmacológico 1,2,3}. El avance de la utilidad de estos modelos agregados relativamente simples depende en gran medida de la caracterización de sus características clave, como la morfología y la densidad celular, que se sabe que influyen tanto en la progresi?…

Materials

96 well plates	Greiner Bio-One	650970	CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
AU565 breast cancer cells	ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
FIJI software	open-source	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267151B
Imaris image analysis software	Bitplane		Current version 9.8
L-glutamine	Lonza	17-605E
Matrigel	Corning	354263
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC
Microscope	Zeiss	Z1 AxioVision
Penicilin streptomycin	Corning	30-0002CI
Plate centrifuge	Eppendorf
RPMI medium 1640	Gibco	11875-085
Spectral Domain Optical Coherence Tomography	ThorLabs	TEL220C1
T75 cell culture flasks	Greiner Bio-One	658175
Trastuzumab			Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy.