El presente protocolo desarrolla una técnica basada en imágenes para la medición rápida, no destructiva y libre de etiquetas de la densidad celular regional y la viabilidad dentro de agregados tumorales 3D. Los hallazgos revelaron un gradiente de densidad celular, con densidades celulares más altas en las regiones centrales que en las capas externas en los agregados en desarrollo y predominantemente muerte celular periférica en agregados HER2+ tratados con Trastuzumab.
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Artículo de método
Evaluación no destructiva de la densidad celular regional dentro de los agregados tumorales después del tratamiento farmacológico
En este artículo
Resumen
Resumen
Los modelos de esferoides tumorales multicelulares (MCTS) han demostrado una utilidad cada vez mayor para el estudio in vitro de la progresión del cáncer y el descubrimiento de fármacos. Estas construcciones avasculares relativamente simples imitan aspectos clave de los tumores in vivo , como la estructura 3D y los gradientes fisiopatológicos. Los modelos MCTS pueden proporcionar información sobre el comportamiento de las células cancerosas durante el desarrollo de esferoides y en respuesta a los medicamentos; sin embargo, su tamaño requerido limita drásticamente las herramientas utilizadas para la evaluación no destructiva. Se exploran imágenes estructurales de tomografía de coherencia óptica y software de análisis 3D Imaris para la medición rápida, no destructiva y sin etiquetas de la densidad celular regional dentro de los MCTS. Este enfoque se utiliza para evaluar los MCTS durante un período de maduración de 4 días y durante un tratamiento prolongado de 5 días con Trastuzumab, un fármaco anti-HER2 clínicamente relevante. Brevemente, los MCTS de cáncer de mama AU565 HER2+ se crearon a través de una superposición líquida con o sin la adición de Matrigel (una matriz de membrana basal) para explorar agregados de diferentes morfologías (agregados 2.5D más gruesos, similares a discos o agregados 2D planos, respectivamente). La densidad celular dentro de la región externa, la región de transición y el núcleo interno se caracterizó en los MCTS maduros, revelando un gradiente de densidad celular con densidades celulares más altas en las regiones centrales en comparación con las capas externas. La adición de la matriz redistribuyó la densidad celular y mejoró este gradiente, disminuyendo la densidad de la zona externa y aumentando la compactación celular en los núcleos. La densidad celular se cuantificó después del tratamiento farmacológico (0 h, 24 h, 5 días) dentro de zonas progresivamente más profundas de 100 μm para evaluar las posibles diferencias regionales en la respuesta al fármaco. En el punto de tiempo final, casi toda la muerte celular parecía estar limitada a los 200 μm externos de cada agregado, mientras que las células más profundas en el agregado parecían en gran medida no afectadas, lo que ilustra las diferencias regionales en la respuesta al fármaco, posiblemente debido a limitaciones en la penetración del fármaco. El protocolo actual proporciona una técnica única para cuantificar de forma no destructiva la densidad celular regional dentro de tejidos celulares densos y medirla longitudinalmente.
Introducción
Los investigadores han recurrido en gran medida a los sistemas in vitro de cultivo 3D de sobremesa para estudiar algunas de las características clave de la progresión tumoral. Gran parte de esta investigación ha sido liderada por la reaparición de esferoides tumorales multicelulares (MCTS) y organoides más complejos 1,2. Aunque estos modelos son avasculares, proporcionan una poderosa herramienta para recapitular los procesos fisiológicos y patológicos que ocurren in vivo 3,4,5. En particular, los mod....
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Protocolo
Para el presente estudio se utilizaron las líneas celulares de cáncer de mama AU565 (HER2+) y MDA-MB-231 (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación de agregados tumorales
- Prepare los medios de crecimiento de células de cáncer de mama AU565 (HER2+) utilizando el medio basal (+) 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) en L-glutamina suplementada con suero bovino fetal al 10% (v/v) y penicilina/estreptomicina al 1% (ver Tabla de materiales).
- Prepare los medios de crecimiento celular de cáncer de mama triple negativos MDA-MB-231 utilizando el Medio de Águila Modificad....
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Resultados
En una publicación anterior, se estableció un método para la medición no destructiva de la densidad celular global dentro de agregados celulares utilizando OCT10. Aquí, esta técnica se extiende para evaluar la densidad celular regional de los agregados celulares en desarrollo. La Figura 1 muestra un esquema de esta extensión, donde la densidad celular se puede evaluar en capas concéntricas de un esferoide o más localmente mirando en su lugar pequeños tapones esféricos.......
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Discusión
Importancia
Los esferoides tumorales multicelulares (MCTS) son potentes modelos 3D in vitro para estudiar la progresión tumoral y el cribadofarmacológico 1,2,3. El avance de la utilidad de estos modelos agregados relativamente simples depende en gran medida de la caracterización de sus características clave, como la morfología y la densidad celular, que se sabe que influyen tanto en la progresión del.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) y NIH R01 CA233188 (MB). Nos gustaría agradecer a AMC Pharmacy por el Trastuzumab proporcionado para estos experimentos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de 96 pocillos | Greiner Bio-One | 650970 | CellStar Superficie repelente de células, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/ |
| 0,25% tripsina, 2,21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| AU565 células de cáncer de mama | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-013-CV | |
| Suero fetal bovino | ATCC | 30-2020 | |
| FIJI software | de código abierto | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Descargado de https://imagej.net/software/fiji/ |
| Hemocitómetro | Fisher Scientific | 0267151B | |
| Software de análisis de imágenes Imaris | Bitplane | Versión actual 9.8 | |
| L-glutamina | Lonza | 17-605E | |
| Matrigel | Corning | 354263 | |
| MDA-MB-231 células de cáncer de mama | Microscopio ATCC | ||
| Zeiss | Z1 AxioVision | ||
| Penicilina estreptomicina | Corning | 30-0002CI | |
| Centrífuga de placa | Eppendorf | ||
| RPMI medio 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| Dominio espectral Tomografía de coherencia óptica | ThorLabs | TEL220C1 | |
| matraces de cultivo celular T75 | Greiner Bio-One | ||
| este estudio se utilizaron muestras clínicas de Trastuzumab Remnant, generosamente donadas por la Farmacia del Colegio Médico de Albany. |
Referencias
- Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer o....
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Reimpresiones y permisos
