İlaç Tedavisini Takiben Tümör Agregaları İçindeki Bölgesel Hücre Yoğunluğunun Tahribatsız Değerlendirilmesi
Summary
Mevcut protokol, 3D tümör agregalarında hızlı, tahribatsız ve etiketsiz bölgesel hücre yoğunluğu ve canlılık ölçümü için görüntü tabanlı bir teknik geliştirmektedir. Bulgular, çekirdek bölgelerde agregaların geliştirilmesinde dış katmanlardan daha yüksek hücre yoğunluklarına ve Trastuzumab ile tedavi edilen HER2 + agregalarında ağırlıklı olarak periferik hücre ölümüne sahip bir hücre yoğunluğu gradyanı ortaya koymuştur.
Abstract
Çok hücreli tümör sferoidi (MCTS) modelleri, kanser progresyonu ve ilaç keşfinin in vitro çalışması için artan yararlılık göstermiştir. Bu nispeten basit avasküler yapılar, 3D yapı ve patofizyolojik gradyanlar gibi in vivo tümörlerin kilit yönlerini taklit eder. MCTS modelleri, küresel gelişim sırasında ve ilaçlara yanıt olarak kanser hücresi davranışı hakkında fikir verebilir; ancak, gerekli boyutları, tahribatsız değerlendirme için kullanılan araçları büyük ölçüde sınırlar. Optik Koherens Tomografi yapısal görüntüleme ve Imaris 3D analiz yazılımı, MCTS’lerde bölgesel hücre yoğunluğunun hızlı, tahribatsız ve etiketsiz ölçümü için araştırılmıştır. Bu yaklaşım, MCTS’leri 4 günlük bir olgunlaşma süresi boyunca ve klinik olarak ilgili bir anti-HER2 ilacı olan Trastuzumab ile genişletilmiş 5 günlük bir tedavi boyunca değerlendirmek için kullanılır. Kısaca, AU565 HER2 + meme kanseri MCTS’leri, farklı morfolojilerin agregalarını (sırasıyla daha kalın, disk benzeri 2.5D agregaları veya düz 2D agregaları) keşfetmek için Matrigel (bir bazal membran matrisi) ilavesi olsun veya olmasın sıvı kaplama yoluyla oluşturuldu. Dış bölge, geçiş bölgesi ve iç çekirdek içindeki hücre yoğunluğu, olgunlaşmış MCTS’lerde karakterize edildi ve çekirdek bölgelerde dış katmanlara kıyasla daha yüksek hücre yoğunluklarına sahip bir hücre yoğunluğu gradyanı ortaya çıkardı. Matris ilavesi hücre yoğunluğunu yeniden dağıttı ve bu gradyanı geliştirdi, dış bölge yoğunluğunu azalttı ve çekirdeklerdeki hücre sıkıştırmasını artırdı. İlaç yanıtındaki potansiyel bölgesel farklılıkları değerlendirmek için giderek daha derin 100 μm bölgelerinde ilaç tedavisini takiben hücre yoğunluğu (0 saat, 24 saat, 5 gün) ölçüldü. Son zaman noktasında, neredeyse tüm hücre ölümünün her bir agreganın dış 200 μm’si ile sınırlı olduğu görülürken, agreganın derinliklerindeki hücreler büyük ölçüde etkilenmemiş görünüyordu ve muhtemelen ilaç penetrasyonundaki sınırlamalar nedeniyle ilaç yanıtındaki bölgesel farklılıkları gösteriyordu. Mevcut protokol, yoğun hücresel dokulardaki bölgesel hücre yoğunluğunu tahribatsız bir şekilde ölçmek ve uzunlamasına ölçmek için benzersiz bir teknik sağlar.
Introduction
Araştırmacılar, tümör progresyonunun bazı temel özelliklerini incelemek için büyük ölçüde in vitro sistemlerde tezgah üstü 3D kültürüne yöneldiler. Bu araştırmanın çoğu, çok hücreli tümör sferoidlerinin (MCTS’ler) ve daha karmaşık organoidlerinyeniden ortaya çıkmasıyla yönlendirilmiştir 1,2. Bu modeller avasküler olmasına rağmen, in vivo 3,4,5 meydana gelen fizyolojik ve patolojik süreçleri özetlemek için güçlü bir araç sağlarlar. Özellikle, orta büyüklükteki modeller (300-500 μm çapında), 3D yapı, patofizyolojik gradyanlar ve çekirdek içindeki hipoksiye bağlı metastatik sinyalleme gibi temel tümör özelliklerini taklit edebilir. Bu modellerin vaskülarize in vivo tümörlerde görülen karakteristik konsantrik tabakaları, yani proliferatif hücrelerin dış tabakasını, yaşlı/sessiz hücrelerin bir geçiş tabakasını ve çekirdekte hipoksi yaşayan hücreleri gösterdiği iyi belgelenmiştir 3,6,7,8,9 . Bu modellerden, bu katmanlar içindeki hücre davranışını karakterize ederek, gelişim sırasında ve ilaca yanıt olarak benzersiz bir anlayış kazanılabilir. Bununla birlikte, onları in vitro modellerde bu kadar güçlü kılan gradyanları geliştirmek için gerekli olan gerekli MCTS boyutu, tahribatsız değerlendirme için kullanılan araçları büyük ölçüde sınırlar. Gerçekten de, MTCS’lerin tahribatsız analizi ile ilgili en büyük zorluklardan biri, hücre ölçeğindeki ayrıntıları ölçmektir. Parlak alan ve faz kontrastı mikroskopisi, 3D MCTS’lerin büyümesini ve gelişimini tahribatsız bir şekilde değerlendirmek için rutin olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu modaliteler 2D projeksiyonlarla sınırlıdır ve bu modellerin10,11,12,13 gibi önemli 3D yapısını görselleştirme kapasitesinden yoksundur. Sitotoksisite ve hücre proliferasyonu ile ilgili bilgiler tipik olarak floresan görüntüleme (yani, ışık tabakası mikroskopisi, konfokal mikroskopi) veya ex vivo immünohistolojik boyama14,15,16 yoluyla toplanır. Bu yaklaşımlar doku yapısı, hücresel yoğunluk ve hücresel fonksiyon hakkında değerli, yüksek çözünürlüklü bilgiler sağlarken, genellikle optik temizleme, sabitleme / boyama veya uzunlamasına analizleri önleyen gömme gibi numune hazırlama gerektirir.
Optik Koherens Tomografi (OKT), yukarıda belirtilen bazı zorlukların üstesinden gelme potansiyeline sahip, tahribatsız bir yapısal görüntüleme yöntemidir. Hücresel çözünürlüğe ve tüm çok hücreli agregaları 17,18,19 görselleştirebilecek kadar geniş bir görüş alanına (10 mm x10 mm’ye kadar) sahiptir. Daha da önemlisi, kullanılan ışığın görünür doğası nedeniyle, bu teknik tamamen tahribatsız ve etiketsizdir17. Ayrıca, numuneler numune hazırlığı gerektirmeden yerinde görüntülenebilir, böylece numuneler doğrudan inkübatörden alınabilir, OCT ile hızlı bir şekilde taranabilir (tarama süresi ~ 5-10 dakika), daha sonra inkübatöre geri döndürülerek uzunlamasına karakterizasyon sağlanabilir. Tümör sferoid davranışını analiz etmek için OKT’yi kullanmayı amaçlayan birçok çalışma yakın zamanda ortaya çıkmıştır. En heyecan verici gösterilerden birinde, Huang ve ark. OCT’yi büyük tümör sferoid modellerindeki nekrotik çekirdekleri tahribatsız bir şekilde tespit etmek için kullandılar ve canlı ve ölü hücre bölgelerinin, etiketsiz canlılık izleme20 için kullanılabilecek optik zayıflamada fark edilebilir farklılıklara sahip olduğunu belirttiler. Benzer şekilde, Hari ve ark., örneklerde hipoksi varlığını incelemek için OCT ile görüntülenen insan kolon kanseri (HCT116) sferoidlerinin kırılma indisi (RI) ölçümlerini gerçekleştirdi21. Ölçümleri doğrudan çıkarımlar için yeterli değildi, ancak daha sonra konfokal mikroskopi ile tanımlanan nekrotik çekirdeklerin alanıyla ilişkili yerlerde, boyut olmasa da daha düşük RI gözlemlediler. Abd El-Sadek ve ark. meme kanseri tümör modellerinin bölgesel doku canlılığını görselleştirmek ve ölçmek için OCT’yi kullandılar22. Doku dinamiklerini görselleştirmek için iki OCT tabanlı yöntem bildirdiler ve bu metriklerdeki farklılıklar ile canlı / ölü hücrelerin mikroskopi ile tanımlanmış bölgeleri arasında ılımlı bir korelasyon gösterdiler.
OCT’yi kullanarak yayınladığımız çalışmamız, gelişim sırasında MCTS’lerin meme kanseri modellerinde 3D morfolojiyi ve hücre sayısını ölçmek için kantitatif, tahribatsız bir yaklaşım oluşturmak için bu önceki literatüre dayanmaktadır10,23. OCT hacim taramalarında görüntülenen hücre boyutundaki nesnelerin (yani lekelerin) sayısını saymak için Imaris 3D render görüntü analiz yazılımı kullanılarak, hücre sayımları, agrega ayrışması üzerine hemositometre ile belirlenenlere istatistiksel olarak benzeyen MCTS’lerde tahribatsız olarak ölçülmüştür. Bununla birlikte, OKT’nin yapısal doğası nedeniyle, nekroz nedeniyle hücre ölümünden sonra hala mevcut olan hücre zarları yanlışlıkla canlı hücreler olarak sayılabilir. Ayrıca, bu karakterizasyon, umut verici bir başarı ile bir ilaç rejimine tabi tutulan bireysel agregalar içindeki hücre canlılığını tahribatsız bir şekilde izlemeye genişletildi10. Önemli olarak, OCT-Imaris yaklaşımımızdan, ayrışma üzerine bu örneklerde karşılaştırılanlarla benzer hücre canlılığının bildirildiği belirtildi. Bu tahribatsız ve etiketsiz hücre yaklaşımı, hücrelerin 3B yapılar içinde ve yoğun agregalar içinde yapı/agrega yapısından ödün vermeden uzunlamasına sayılmasını sağlar.
Bu çalışma, OCT-Imaris’in hem 3D agrega morfolojisini hem de hücre sayısını ölçme yeteneğinden yararlanarak yoğun agregalar içindeki bölgesel hücre yoğunluğunu doğrudan ölçmek için geliştirilmiş bir yaklaşım bildirmektedir. Bu metodolojik ilerleme, MCTS modellerinin karakteristik eşmerkezli katmanları içinde hücrelerin uzamsal dağılımının ve proliferasyonunun daha ayrıntılı bir resmini sağlar. Genel bir ortalama toplam hücre yoğunluğunu hesaplamak yerine, bu tür yerel yoğunluk ölçümleri, sıkıştırma ile ilişkili olanlar gibi hücre yoğunluğu gradyanlarını ortaya çıkarabilir. Bu bölgesel değerlendirme, lokal hücre yoğunluğundaki değişikliklerle ölçüldüğü gibi, bölgesel ilaç yanıtını değerlendirmek için kemoterapötik ile tedavi edilen agregalara da uygulanır. OCT ve gelişmiş görüntüleme analiz yöntemlerinin bu kombinasyonu, hangi bölgelerin hücre yoğunluğunda azalma yaşadığına bağlı olarak ilaç penetrasyonunu araştırmak için kullanılabilecek bölgesel hücre canlılığının ölçülmesini sağlar. Bu, yoğun hücresel dokulardaki ilaca yanıt olarak bölgesel hücre yoğunluğunu ve canlılığını tahribatsız bir şekilde ölçen ve uzunlamasına ölçen ilk rapordur. Üç boyutlu hücre yoğunluğunun ve tüm MCTS’ler boyunca uzamsal dağılımın bu şekilde karakterize edilmesi, kanser tedavisinde ilaç dağıtımını optimize etmeye ve kanser modelinin ilerlemesinin anlaşılmasını geliştirmeye yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mana
Çok hücreli tümör sferoidleri (MCTS’ler), tümör progresyonunu ve ilaç taramasını incelemek için güçlü 3D in vitro modellerdir 1,2,3. Bu nispeten basit agrega modellerinin faydasını ilerletmek, hem tümör modeli progresyonunu hem de terapötik yanıtı etkilediği bilinen morfoloji ve hücre yoğunluğu gibi temel özelliklerinin karakterizasyonuna büyük ölçüde dayanır. Bunu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) ve NIH R01 CA233188 (MB) tarafından desteklenmiştir. Bu deneyler için sağlanan Trastuzumab için AMC Eczanesi’ne teşekkür ederiz.
Materials
| 96 well plates | Greiner Bio-One | 650970 | CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/ |
| 0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| AU565 breast cancer cells | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| FIJI software | open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267151B | |
| Imaris image analysis software | Bitplane | Current version 9.8 | |
| L-glutamine | Lonza | 17-605E | |
| Matrigel | Corning | 354263 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | ||
| Microscope | Zeiss | Z1 AxioVision | |
| Penicilin streptomycin | Corning | 30-0002CI | |
| Plate centrifuge | Eppendorf | ||
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| Spectral Domain Optical Coherence Tomography | ThorLabs | TEL220C1 | |
| T75 cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Trastuzumab | Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy. |
Referencias
- Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
- Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Investigación sobre el cáncer. 46 (7), 3504-3512 (1986).
- Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
- Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
- Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
- Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
- Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
- Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
- Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
- Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Investigación sobre el cáncer. 77 (21), 6011-6020 (2017).
- Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844 (2021).
- Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
- Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
- Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947 (2013).
- Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102 (2017).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
- Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124 (2014).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760 (2021).
- . High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015)
- Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
- Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).
