Détermination de l’efficacité d’accouplement des haploïdes chez Saccharomyces cerevisiae

Summary

Dans ce travail, une méthode robuste pour la quantification de l’efficacité de l’accouplement chez la levure Saccharomyces cerevisiae est décrite. Cette méthode est particulièrement utile pour la quantification des barrières pré-zygotiques dans les études de spéciation.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae est un organisme modèle largement utilisé en génétique, en évolution et en biologie moléculaire. Ces dernières années, il est également devenu un organisme modèle populaire pour étudier les problèmes liés à la spéciation. Le cycle de vie de la levure implique à la fois des phases de reproduction asexuée et sexuée. La facilité d’effectuer des expériences d’évolution et le court temps de génération de l’organisme permettent d’étudier l’évolution des barrières reproductives. L’efficacité avec laquelle les deux types d’accouplement (a et α) s’accouplent pour former le diploïde a/α est appelée efficacité d’accouplement. Toute diminution de l’efficacité de l’accouplement entre haploïdes indique une barrière pré-zygote. Ainsi, pour quantifier l’étendue de l’isolement reproductif entre deux haploïdes, une méthode robuste pour quantifier l’efficacité de l’accouplement est nécessaire. À cette fin, un protocole simple et hautement reproductible est présenté ici. Le protocole comprend quatre étapes principales, qui comprennent le rapiéçage des haploïdes sur une plaque YPD, le mélange des haploïdes en nombre égal, la dilution et le placage pour les colonies individuelles, et enfin, le calcul de l’efficacité en fonction du nombre de colonies sur une plaque de chute. Des marqueurs auxotrophes sont utilisés pour faire clairement la distinction entre les haploïdes et les diploïdes.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, communément appelée levure bourgeonnante, est un eucaryote unicellulaire. Il a deux types d’accouplement, a et α, et présente à la fois des cycles de reproduction asexuée et sexuée. Les types d’accouplement a et α sont haploïdes et peuvent se diviser mitotiquement en l’absence de l’autre type d’accouplement dans le milieu environnant, qui représente le cycle asexué de la levure. Lorsque les deux types d’accouplement sont à proximité, ils cessent de se diviser mitotiquement et fusionnent pour former une cellule diploïde. La levure diploïde peut soit se diviser mitotiquement lorsque des nutriments sont présents, soit subir une méiose dans des conditions de privation d’azote en présence d’une source de carbone pauvre et non fermentescible, telle que l’acétate¹. Il en résulte la formation de spores, qui restent dormantes jusqu’à ce que les conditions de croissance soient favorables. Le cycle de vie est terminé lorsque ces spores germent et que les deux types haploïdes sont relâchés dans le pool haploïde ^2,3 (Figure 1).

L’accouplement des cellules de levure comprend plusieurs étapes, telles que l’agglutination, la formation d’une projection d’accouplement ou « shmoo », suivie de la fusion cellulaire et nucléaire ^4,5. Les deux types d’accouplement a et α produisent respectivement un facteur a et un facteur α pour initier l’accouplement. Ces facteurs sont des phéromones polypeptidiques qui se lient aux récepteurs (Ste2 et Ste3) présents à la surface cellulaire de l’accouplement opposé de type⁵. La liaison des phéromones aux récepteurs initie la voie de réponse des phéromones, la voie de transduction du signal^de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) ^6,7,8. Il en résulte l’arrêt du cycle cellulaire dans la phase G1, conduisant à une phase stationnaire^{métaboliquement active 9}. Les cellules cessent alors de se diviser mitotiquement, et les protéines nécessaires à l’accouplement sont synthétisées. Comme les cellules haploïdes ne peuvent pas se déplacer les unes vers les autres, une projection d’accouplement ou « shmoo » est dirigée vers le partenaire d’accouplement. Lorsque les cellules entrent en contact, la paroi cellulaire est dégradée et le contenu cytoplasmique fusionne, ce qui entraîne l’accouplement pour former une cellule diploïde^10,11. L’efficacité d’accouplement entre haploïdes a été utilisée comme mesure de la spéciation dans les souches développées en laboratoire, ainsi qu’entre les espèces existantes¹².

Étant un organisme eucaryote simple, la levure est le modèle de choix pour un grand nombre de questions de recherche associées aux organismes eucaryotes complexes. L’une de ces questions est associée à la spéciation et à l’évolution des barrières de reproduction^13,14. Pour les organismes à reproduction sexuée, une espèce est définie par le concept d’espèce biologique (BSC) proposé par Ernst Mayr¹⁵. Selon ce concept, deux individus d’une population sont dits appartenir à deux espèces différentes s’ils ne peuvent pas se croiser et sont isolés sur le plan de la reproduction. La rupture du cycle de reproduction sexuée (qui implique la fusion des gamètes pour former un zygote, le développement du zygote en une progéniture et l’atteinte de la maturité sexuelle dans la progéniture) conduit à l’isolement reproductif. Comme le montre la figure 1, le cycle de vie de S. cerevisiae est comparable au cycle de reproduction sexuée : a) la fusion des deux types d’accouplement a et α est similaire à la fusion des gamètes dans les organismes à reproduction sexuée; b) la capacité du diploïde à subir une division mitotique équivaut au développement du zygote en descendance; et c) le diploïde subissant une sporulation est comparable au processus de gamétogenèse¹⁴.

L’isolement pré-zygotique se produit lorsque l’accouplement assortatif est observé. Avec une chance égale de s’accoupler avec deux types A génétiquement différents, un type α s’accouple préférentiellement avec l’un plutôt qu’avec l’autre ou vice versa¹⁴. Dans le cas d’expériences d’évolution dans lesquelles les haploïdes ont évolué dans différents environnements, la présence d’une barrière de pré-accouplement peut être déterminée en effectuant un test d’accouplement. Une diminution de l’efficacité de l’accouplement par rapport à l’ancêtre indique l’évolution d’une barrière pré-accouplement. L’isolement post-zygotique peut survenir en raison de l’incapacité du diploïde à subir une division mitotique efficace et/ou une sporulation pour former des spores haploïdes¹⁴. Ceux-ci peuvent être quantifiés en mesurant le taux de croissance des diploïdes et en calculant l’efficacité de la sporulation, respectivement. Par conséquent, pour étudier l’évolution des barrières de reproduction, des méthodes robustes pour quantifier (a) l’efficacité de l’accouplement, (b) la croissance mitotique du diploïde et (c) l’efficacité de sporulation du diploïde sont nécessaires. Dans ce travail, une méthode robuste pour quantifier l’efficacité d’accouplement des souches de levure est rapportée.

Dans les expériences de laboratoire, l’un des moyens de détecter l’accouplement consiste à utiliser des marqueurs auxotrophes qui complètent les besoins nutritionnels. Lorsque les deux types d’accouplement sont auxotrophes pour deux acides aminés différents, seule la cellule diploïde formée par la fusion des deux types d’accouplement peut se développer sur un milieu déficient en deux acides aminés. Ainsi, les marqueurs auxotrophes sont utiles pour détecter l’accouplement à la fois qualitativement et quantitativement. Un test qualitatif suffira pour identifier le type d’accouplement d’une souche après la méiose¹⁶. Les tests quantitatifs sont essentiels lorsque l’on s’intéresse à l’identification d’une réduction de l’accouplement tout en étudiant les gènes impliqués dans la voie d’accouplement^17,18. En outre, la levure étant de plus en plus utilisée dans les études de spéciation, un essai d’accouplement pratique et reproductible est nécessaire, car la quantification de l’efficacité de l’accouplement est une mesure de la barrière pré-zygotique.

L’efficacité d’accouplement entre les deux types d’accouplement de levure a été quantifiée précédemment^16,19,20. La plupart des méthodes utilisées précédemment sont similaires dans leur conception avec quelques variations 16,21,22,23,24,25. Certains d’entre eux utilisent des cultures en phase logarithmique précoce, tandis que quelques autres utilisent des cultures en phase logarithmique de souches haploïdes. Il existe des variations dans les rapports dans lesquels les deux types d’accouplement sont mélangés. Presque tous les protocoles utilisent une membrane de nitrocellulose. Les suspensions des deux types d’accouplement prélevées sur des cultures antérieures sont mélangées et filtrées sur une membrane de nitrocellulose placée sur une plaque YPD. Dans l’une des variantes du protocole, la suspension haploïde est directement rapiécée sur une plaque YPD²¹. Dans les expériences portant sur les gènes impliqués dans la production de phéromones des deux types d’accouplement, les phéromones sont ajoutées à l’extérieur tout en rendant les suspensions des deux types d’accouplement²⁴.

Après une incubation de quelques heures (généralement environ 5 h) après le mélange des haploïdes, les cellules sont lavées de la membrane, diluées et plaquées sur des milieux sélectifs. Dans l’une des méthodes antérieures rapportées en 1973, l’efficacité de la formation ou de l’accouplement de zygotes a été calculée en comptant le nombre de cellules bourgeonnées, de cellules non bourgeonnées et de paires d’accouplement au microscope à l’aide d’un hémocytomètre²⁶. Cependant, la plupart des méthodes rapportées plus tard utilisent des marqueurs auxotrophes pour distinguer les haploïdes et les diploïdes. L’efficacité d’accouplement est calculée comme le pourcentage de cellules diploïdes par rapport au nombre de cellules diploïdes et haploïdes dans le pool cellulaire 16,21,23.

Cependant, malgré un certain nombre de rapports utilisant la levure comme organisme modèle pour étudier la spéciation, il n’existe pas de protocole normalisé rapporté dans la littérature jusqu’à présent pour calculer l’efficacité de l’accouplement. Les cellules en phase logarithmique peuvent ne pas être idéales pour la quantification de l’efficacité de l’accouplement. Pendant l’accouplement, le cycle cellulaire des deux haploïdes est arrêté et, par conséquent, les cellules pendant l’accouplement ne se divisent pas⁹. Comme le cycle cellulaire est également connu pour être arrêté de la même manière dans les cellules dans la phase stationnaire²⁷, l’utilisation de telles cellules peut rendre le protocole plus reproductible. Les cellules en phase stationnaire peuvent être mélangées et disposées sur des plaques YPD (c.-à-d. un environnement riche sur le plan nutritionnel) pour l’accouplement. Les procédures conventionnelles nécessitent également une membrane de nitrocellulose et le lavage des cellules, ce qui rend le processus lourd et susceptible d’entraîner des erreurs de manipulation. De plus, les protocoles utilisés à ce jour quantifient l’efficacité de l’accouplement en termes d’un haploïde. Cependant, lors de la mesure de l’isolement reproductif, l’efficacité de l’accouplement est quantifiée pour une combinaison particulière d’haploïdes plutôt que pour un seul haploïde.

Pour résoudre ces problèmes, nous rapportons ici une méthode robuste pour la quantification de l’efficacité d’accouplement chez la levure qui est hautement reproductible et facile à utiliser. De plus, cette méthode et les souches de levure employées ici peuvent également être utilisées dans des études examinant l’effet du flux génétique sur l’évolution des barrières d’accouplement.

Deux souches différentes de S. cerevisiae ont été utilisées dans cette étude. L’une des souches est dérivée du fond SK1; cela a été modifié dans notre laboratoire en ajoutant les marqueurs auxotrophes près du locus MAT. Les génotypes résultants des haploïdes sont fournis dans le tableau 1^28,29,30. Dans la souche SK1, le gène TRP1 a été inséré près du locus MAT et l’haploïde α a inséré le gène LEU2 près du locus MAT. Dans la souche ScAM, les gènes TRP1 et URA3 ont été insérés dans les haploïdes a et α, respectivement. L’emplacement de l’insertion était dans la région ARS du chromosome III (Chr III: 197378..197609). Pour le protocole rapporté ici, des marqueurs auxotrophes n’importe où sur le génome suffiraient. Cependant, le fait d’avoir les marqueurs auxotrophes près du locus MAT signifie que ces souches peuvent également être utilisées pour des études examinant l’effet du flux génétique sur la spéciation^31,32. Les marqueurs ont été ajoutés près du locus MAT pour empêcher le remaniement des marqueurs dû à la recombinaison. Par conséquent, ce protocole peut être utilisé pour quantifier l’efficacité de l’accouplement dans les études impliquant la spéciation et également pour identifier l’altération de l’efficacité de l’accouplement lors de l’étude des protéines impliquées dans la voie d’accouplement.

Protocol

NOTE: Le protocole comprend globalement les étapes suivantes: (1) patcher les haploïdes dans les grilles d’efficacité d’accouplement sur une plaque YPD, (2) mélanger les haploïdes en nombre égal après 24 heures d’incubation et donner aux haploïdes mixtes quelques heures pour s’accoupler (7 h dans cette étude), (3) placage des cellules mélangées sur YPD pour isoler les colonies individuelles après 7 h à 30 ° C, et enfin, (4) déterminer le nombre de diploïdes formés à l’aide des marqueurs auxot…

Representative Results

Quantification de l’efficacité d’accouplement des deux types d’accouplementLe protocole décrit ici a été utilisé pour quantifier l’efficacité d’accouplement entre deux souches de levure – entre SK1AM a et SK1AM α et entre ScAMa et ScAM α (Figure 3A). Dans ces expériences, l’accouplement entre les deux haploïdes a été répété au moins 12 fois. Dans chacune des répétitions de l…

Discussion

La quantification de l’efficacité de l’accouplement chez S. cerevisiae est essentielle pour réaliser des études liées aux gènes impliqués dans les voies d’accouplement ou étudier l’influence de l’environnement externe sur le comportement d’accouplement. Au cours des deux dernières décennies, S. cerevisiae est également devenu un modèle populaire pour répondre aux questions liées à la spéciation 14,36,37,38.<…

Materials

Adenine	Sigma Life Science	A8626
Agar Powder regular grade for bacteriology	SRL	19661 (0140186)
Ammonium Sulphate, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-glucose	Sigma Life Science	G8270
Glass Petri plates	HiMedia	PW008	90 mm x 15 mm dimension
L-Arginine	Sigma Life Science	A8094
L-Aspartic acid	Sigma Life Science	A7219
L-Histidine monochloride monohydrate	Sigma Life Science	H5659
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Life Science	L8912
L-Lysine	Aldrich	62840
L-Methionine	Sigma Life Science	M5308
L-Phenylalanine	Sigma Life Science	P5482
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tyrosine	Sigma Life Science	T8566
L-Valine	Sigma Life Science	V0513
Mating efficiency grid			1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate
Microcentrifuge tubes	Tarsons	500010
Peptone	HiMedia	RM001
Uracil	Sigma Life Science	U0750
Yeast Extract Powder	HiMedia	RM027
Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate	BD Difco	233520