Determinação da eficiência de acasalamento de haploides em Saccharomyces cerevisiae

Summary

Neste trabalho, um método robusto para a quantificação da eficiência reprodutiva da levedura Saccharomyces cerevisiae é descrito. Este método é particularmente útil para a quantificação de barreiras pré-zigóticas em estudos de especiação.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae é um organismo modelo amplamente utilizado em genética, evolução e biologia molecular. Nos últimos anos, tornou-se também um organismo modelo popular para estudar problemas relacionados à especiação. O ciclo de vida da levedura envolve as fases reprodutiva assexuada e sexuada. A facilidade de realizar experimentos evolutivos e o curto tempo de geração do organismo permitem o estudo da evolução das barreiras reprodutivas. A eficiência com que os dois tipos de acasalamento (a e α) se acasalam para formar o diploide a/α é referida como a eficiência de acasalamento. Qualquer diminuição na eficiência de acasalamento entre os haploides indica uma barreira pré-zigótica. Assim, para quantificar a extensão do isolamento reprodutivo entre dois haploides, um método robusto para quantificar a eficiência reprodutiva é necessário. Para tanto, um protocolo simples e altamente reprodutível é apresentado aqui. O protocolo envolve quatro etapas principais, que incluem remendar os haploides em uma placa YPD, misturar os haploides em números iguais, diluir e plaquear para colônias únicas e, finalmente, calcular a eficiência com base no número de colônias em uma placa de drop-out. Marcadores auxotróficos são empregados para fazer claramente a distinção entre haploides e diploides.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, comumente chamada de levedura brotante, é um eucariota unicelular. Tem dois tipos de acasalamento, a e α, e exibe ciclos reprodutivos assexuados e sexuados. Os tipos de acasalamento a e α são haploides e podem se dividir mitoticamente na ausência do outro tipo de acasalamento no ambiente circundante, que representa o ciclo assexuado das leveduras. Quando os dois tipos de acasalamento estão próximos, eles param de se dividir mitoticamente e se fundem para formar uma célula diploide. A levedura diploide pode se dividir mitoticamente quando os nutrientes estão presentes ou sofrer meiose sob condições de carência de nitrogênio na presença de uma fonte pobre de carbono não fermentável, como o acetato¹. Isso resulta na formação de esporos, que permanecem dormentes até que haja condições favoráveis de crescimento. O ciclo de vida se completa quando esses esporos germinam e os dois tipos haploides são liberados de volta ao pool haploide ^2,3 (Figura 1).

O acasalamento de células leveduriformes inclui várias etapas, como aglutinação, formação de uma projeção de acasalamento ou “shmoo”, seguida de fusão celular e nuclear ^4,5. Os dois tipos de acasalamento a e α produzem um fator a e um fator α, respectivamente, para iniciar o acasalamento. Esses fatores são feromônios polipeptídicos que se ligam aos receptores (Ste2 e Ste3) presentes na superfície celular do tipo oposto de acasalamento⁵. A ligação dos feromônios aos receptores inicia a via de resposta aos feromônios, a via de transdução do sinal da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) ^6,7,8. Isso resulta na parada do ciclo celular na fase G1, levando a uma fase estacionária metabolicamente ativa⁹. As células então param de se dividir mitoticamente, e as proteínas necessárias para o acasalamento são sintetizadas. Como as células haploides não podem se mover umas em direção às outras, uma projeção de acasalamento ou “shmoo” é direcionada para o parceiro de acasalamento. Quando as células entram em contato, a parede celular é degradada e o conteúdo citoplasmático se funde, resultando no acasalamento para formar uma célula diploide^10,11. A eficiência de acasalamento entre haploides tem sido utilizada como medida de especiação em linhagens evoluídas em laboratório, bem como entre espécies existentes¹².

Sendo um simples organismo eucariótico, a levedura é o modelo de escolha para um grande número de questões de pesquisa associadas a organismos eucarióticos complexos. Uma dessas questões está associada à especiação e à evolução das barreiras reprodutivas^13,14. Para organismos sexualmente reprodutores, uma espécie é definida pelo conceito biológico de espécie (BSC) proposto por Ernst Mayr¹⁵. De acordo com esse conceito, dois indivíduos de uma população pertencem a duas espécies diferentes se não puderem cruzar e forem isolados reprodutivamente. A quebra do ciclo reprodutivo sexual (que envolve a fusão de gametas para formar um zigoto, o desenvolvimento do zigoto em uma progênie e a obtenção da maturidade sexual na progênie) leva ao isolamento reprodutivo. Como mostrado na Figura 1, o ciclo de vida de S. cerevisiae é comparável ao ciclo reprodutivo sexual: a) a fusão dos dois tipos de acasalamento a e α é semelhante à fusão de gametas em organismos sexualmente reprodutores; b) a capacidade do diploide de sofrer divisão mitótica é equivalente ao zigoto que se desenvolve em progênie; e c) o diploide submetido à esporulação é comparável ao processo de gametogênese14.

O isolamento pré-zigótico ocorre quando se observa acasalamento assortativo. Dada a mesma oportunidade de acasalar com dois tipos geneticamente diferentes, um tipo α acasala preferencialmente com um em detrimento do outro ou vice-versa¹⁴. No caso de experimentos evolutivos em que haploides foram evoluídos em diferentes ambientes, a presença de uma barreira pré-acasalamento pode ser determinada através da realização de um ensaio de acasalamento. Uma diminuição na eficiência de acasalamento quando comparada ao ancestral indica a evolução de uma barreira pré-acasalamento. O isolamento pós-zigótico pode surgir devido à incapacidade do diploide de sofrer divisão mitótica efetiva e/ou esporulação para formar esporos haploides¹⁴. Estes podem ser quantificados medindo-se a taxa de crescimento dos diploides e calculando-se a eficiência de esporulação, respectivamente. Assim, para estudar a evolução das barreiras reprodutivas, são necessários métodos robustos para quantificar (a) a eficiência de acasalamento, (b) o crescimento mitótico do diploide e (c) a eficiência de esporulação do diploide. Neste trabalho, um método robusto para quantificar a eficiência reprodutiva de linhagens de leveduras é relatado.

Em experimentos de laboratório, uma das formas pelas quais a ocorrência de acasalamento pode ser detectada é por meio do uso de marcadores auxotróficos que complementam as necessidades nutricionais. Quando os dois tipos de acasalamento são auxotróficos para dois aminoácidos diferentes, apenas a célula diploide formada pela fusão dos dois tipos de acasalamento pode crescer em um meio deficiente em ambos os aminoácidos. Assim, marcadores auxotróficos são úteis para detectar acasalamentos qualitativa e quantitativamente. Um teste qualitativo será suficiente para identificar o tipo de acasalamento de uma cepa após a meiose¹⁶. Testes quantitativos são essenciais quando se está interessado em identificar uma redução no acasalamento enquanto se estudam os genes envolvidos na via de acasalamento^17,18. Além disso, com leveduras sendo cada vez mais utilizadas em estudos de especiação, um ensaio de acasalamento conveniente e reprodutível é necessário, uma vez que a quantificação da eficiência reprodutiva é uma medida da barreira pré-zigótica.

A eficiência reprodutiva entre os dois tipos de acasalamento de leveduras foi quantificada previamente^16,19,20. A maioria dos métodos utilizados anteriormente são semelhantes em seu desenho, com algumas variações 16,21,22,23,24,25. Alguns deles usam culturas de fase log inicial, enquanto alguns outros usam culturas de fase média de log de cepas haploides. Há variações nas proporções em que os dois tipos de acasalamento são misturados. Quase todos os protocolos utilizam membrana de nitrocelulose. Suspensões de ambos os tipos de acasalamento retiradas de culturas previamente cultivadas são misturadas e filtradas em uma membrana de nitrocelulose colocada em uma placa YPD. Em uma das variações do protocolo, a suspensão haploide é diretamente remendada em uma placa YPD²¹. Em experimentos que tratam dos genes envolvidos na produção de feromônios dos dois tipos de acasalamento, os feromônios são adicionados externamente durante a confecção das suspensões dos dois tipos de acasalamento²⁴.

Após a incubação por algumas horas (tipicamente em torno de 5 h) após a mistura dos haploides, as células são lavadas da membrana, diluídas e plaqueadas em meios seletivos. Em um dos métodos anteriores relatados em 1973, a eficiência da formação de zigoto ou acasalamento foi calculada pela contagem do número de células brotadas, células não brotadas e pares de acasalamento sob um microscópio usando um hemocitômetro²⁶. No entanto, a maioria dos métodos relatados posteriormente usa marcadores auxotróficos para distinguir haploides e diploides. A eficiência de acasalamento é calculada como a porcentagem de células diploides em relação ao número de células diploides e haploides no pool celular 16,21,23.

No entanto, apesar de vários relatos usando leveduras como um organismo modelo para estudar a especiação, não há nenhum protocolo padronizado relatado na literatura até o momento para calcular a eficiência do acasalamento. Células na fase logarítmica podem não ser ideais para a quantificação da eficiência de acasalamento. Durante o acasalamento, o ciclo celular dos dois haploides é interrompido e, portanto, as células durante o acasalamento não estão se dividindo⁹. Como o ciclo celular também é conhecido por ser igualmente preso em células na fase estacionária²⁷, o uso dessas células pode tornar o protocolo mais reprodutível. As células de fase estacionária podem ser misturadas e dispostas em placas YPD (ou seja, um ambiente nutricionalmente rico) para o acasalamento. Os procedimentos convencionais também exigem uma membrana de nitrocelulose e lavagem das células, tornando o processo complicado e passível de erros de manuseio. Além disso, os protocolos utilizados até o momento quantificam a eficiência de acasalamento em termos de um haploide. No entanto, ao medir o isolamento reprodutivo, a eficiência de acasalamento é quantificada para uma combinação particular de haploides em vez de um único haploide.

Para resolver essas questões, aqui relatamos um método robusto para a quantificação da eficiência de acasalamento em leveduras que é altamente reprodutível e fácil de usar. Além disso, este método e as linhagens de leveduras empregadas aqui também podem ser usados em estudos que examinam o efeito do fluxo gênico na evolução das barreiras de acasalamento.

Duas cepas diferentes de S. cerevisiae foram utilizadas neste estudo. Uma das cepas é derivada do fundo SK1; isso foi modificado em nosso laboratório pela adição dos marcadores auxotróficos próximos ao locus MAT. Os genótipos resultantes dos haploides, estão apresentados na Tabela 1^28,29,30. Na cepa SK1, o haploide a teve o gene TRP1 inserido próximo ao locus MAT, e o haploide α teve o gene LEU2 inserido próximo ao locus MAT. Na cepa ScAM, os genes TRP1 e URA3 foram inseridos nos haploides a e α, respectivamente. O local de inserção foi na região ARS do cromossomo III (Chr III: 197378..197609). Para o protocolo aqui relatado, marcadores auxotróficos em qualquer lugar do genoma seriam suficientes. No entanto, ter os marcadores auxotróficos próximos ao locus MAT significa que essas cepas também podem ser usadas para estudos que examinam o efeito do fluxo gênico na especiação^31,32. Os marcadores foram adicionados próximos ao locus MAT para evitar o remanejamento dos marcadores devido à recombinação. Assim, este protocolo pode ser utilizado para quantificar a eficiência reprodutiva em estudos envolvendo especiação e também para identificar a alteração da eficiência reprodutiva ao estudar as proteínas envolvidas na via de acasalamento.

Protocol

NOTA: O protocolo envolve amplamente as seguintes etapas: (1) remendar os haploides nas grades de eficiência de acasalamento em uma placa YPD, (2) misturar os haploides em números iguais após 24 h de incubação e dar aos haploides mistos algumas horas para acasalar (7 h neste estudo), (3) plaquear as células mistas em YPD para isolar colônias únicas após 7 h a 30 °C, e, finalmente, (4) determinação do número de diploides formados pelos marcadores auxotróficos. Essas etapas são discutidas em detalhes a segu…

Representative Results

Quantificação da eficiência reprodutiva dos dois tipos de acasalamentoO protocolo aqui descrito foi utilizado para quantificar a eficiência reprodutiva entre duas linhagens de leveduras – entre SK1AM a e SK1AM α e entre ScAMa eScAM α (Figura 3A). Nesses experimentos, o acasalamento entre os dois haploides foi repetido pelo menos 12 vezes. Em cada uma das repetições do experimento, pelo menos 100…

Discussion

A quantificação da eficiência reprodutiva em S. cerevisiae é essencial para a realização de estudos relacionados aos genes envolvidos nas vias de acasalamento ou para o estudo da influência do ambiente externo no comportamento reprodutivo. Nas últimas duas décadas, S. cerevisiae também se tornou um modelo popular para abordar questões relacionadas à especiação14,36,37,38.<sup class="xre…

Materials

Adenine	Sigma Life Science	A8626
Agar Powder regular grade for bacteriology	SRL	19661 (0140186)
Ammonium Sulphate, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-glucose	Sigma Life Science	G8270
Glass Petri plates	HiMedia	PW008	90 mm x 15 mm dimension
L-Arginine	Sigma Life Science	A8094
L-Aspartic acid	Sigma Life Science	A7219
L-Histidine monochloride monohydrate	Sigma Life Science	H5659
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Life Science	L8912
L-Lysine	Aldrich	62840
L-Methionine	Sigma Life Science	M5308
L-Phenylalanine	Sigma Life Science	P5482
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tyrosine	Sigma Life Science	T8566
L-Valine	Sigma Life Science	V0513
Mating efficiency grid			1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate
Microcentrifuge tubes	Tarsons	500010
Peptone	HiMedia	RM001
Uracil	Sigma Life Science	U0750
Yeast Extract Powder	HiMedia	RM027
Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate	BD Difco	233520