出芽酵母における一倍体の交配効率の決定

Summary

この研究では、酵母 サッカロマイセス・セレビシエ の交配効率を定量化するための堅牢な方法が説明されています。この方法は、スペシエーション研究における前接合体障壁の定量化に特に有用です。

Abstract

サッカロミセス・セレビシエは、遺伝学、進化学、分子生物学において広く使用されているモデル生物です。近年では、種分化に関連する問題を研究するための人気のあるモデル生物にもなっています。酵母のライフサイクルには、無性生殖段階と有性生殖段階の両方が含まれます。進化実験の容易さと生物の短い世代時間は、生殖障壁の進化の研究を可能にします。2つの嵌合タイプ(aとα)が嵌合してa/α二倍体を形成する効率は、嵌合効率と呼ばれます。一倍体間の交配効率の低下は、前接合体障壁を示しています。したがって、2つの一倍体間の生殖隔離の程度を定量化するには、交配効率を定量化する堅牢な方法が必要です。この目的のために、シンプルで再現性の高いプロトコルがここに提示されます。このプロトコルには、YPDプレート上のハプロイドのパッチ適用、等数のハプロイドの混合、単一コロニーの希釈とプレーティング、そして最後にドロップアウトプレート上のコロニー数に基づく効率の計算を含む4つの主要なステップが含まれます。栄養要求性マーカーは、一倍体と二倍体を明確に区別するために使用されます。

Introduction

一般に出芽酵母と呼ばれるサッカロミセスセレビシエは、単細胞真核生物です。交配タイプはaとαの2種類で、無性生殖周期と有性生殖周期の両方を示します。aおよびα交配タイプは一倍体であり、酵母の無性サイクルを表す周囲の環境に他の交配タイプがない場合、有糸分裂的に分裂する可能性があります。2つの交配タイプが近接している場合、それらは有糸分裂を停止し、融合して二倍体細胞を形成します。二倍体酵母は、栄養素が存在するときに有糸分裂するか、酢酸¹などの非発酵性の貧弱な炭素源の存在下で窒素飢餓の条件下で減数分裂を起こすことができます。これにより胞子が形成され、良好な成長条件が得られるまで休眠状態が残ります。これらの胞子が発芽し、2つの一倍体タイプが一倍体プールに放出されると、ライフサイクルが完了します^2,3(図1)。

酵母細胞の交配には、凝集、交配突起または「shmoo」の形成、それに続く細胞および核融合などのいくつかのステップが含まれます^4,5。2 つの嵌合タイプ a と α は、それぞれ a 因子と α 因子を生成し、嵌合を開始します。これらの因子は、反対の交配型⁵の細胞表面に存在する受容体(Ste2およびSte3)に結合するポリペプチドフェロモンである。フェロモンの受容体への結合は、フェロモン応答経路、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)シグナル伝達経路を開始する⁶、^7、8。これは、G1期における細胞周期の停止をもたらし、代謝的に活性な固定期⁹をもたらす。その後、細胞は有糸分裂を停止し、交配に必要なタンパク質が合成されます。一倍体細胞は互いに向かって移動できないため、交尾投影または「shmoo」が交尾相手に向けられます。細胞が接触すると、細胞壁が分解され、細胞質内容物が融合して交配して二倍体細胞^10,11を形成する。一倍体間の交配効率は、実験室で進化した株、および現存種間の種分化の尺度として使用されてきました¹²。

単純な真核生物であるため、酵母は複雑な真核生物に関連する多数の研究課題に最適なモデルです。そのような質問の1つは、種分化と生殖障壁の進化に関連しています^13,14。有性生殖生物の場合、種はエルンストマ^イヤー15によって提案された生物種の概念(BSC)によって定義されます。この概念によれば、集団の2つの個体は、交配できず、生殖的に分離されている場合、2つの異なる種に属すると言われます。性的生殖周期の崩壊(配偶子の融合による接合子の形成、接合子の子孫への発達、および子孫の性的成熟の達成を含む)は、生殖隔離につながります。図1に示すように、S. cerevisiaeの生活環は有性生殖周期に匹敵します:a)2つの交配タイプaとαの融合は、有性生殖生物における配偶子の融合に似ています。b)二倍体が有糸分裂を受ける能力は、接合子が子孫に発達することと同等である。c)胞子形成を受けている二倍体は、配偶子形成のプロセスに匹敵します¹⁴。

前接合子の分離は、品揃え交配が観察されたときに起こります。遺伝的に異なる2つの a タイプと交配する平等な機会が与えられると、 α タイプは優先的に一方と他方よりも、またはその逆に交配します¹⁴。一倍体が異なる環境で進化した進化実験の場合、嵌合アッセイを行うことで、嵌合前の障壁の存在を判定することができる。祖先と比較した場合の交配効率の低下は、交配前の障壁の進化を示しています。接合後の分離は、二倍体が効果的な有糸分裂および/または胞子形成を受けて一倍体胞子を形成することができないために発生する可能性があります¹⁴。これらは、二倍体の増殖速度を測定し、胞子形成効率をそれぞれ計算することによって定量することができる。したがって、生殖障壁の進化を研究するためには、(a)交配効率、(b)二倍体の有糸分裂成長、および(c)二倍体の胞子形成効率を定量化するための堅牢な方法が必要です。本研究では、酵母株の交配効率を定量化する堅牢な方法が報告されています。

実験室での実験では、交配の発生を検出できる方法の1つは、栄養要件を補完する栄養要求性マーカーを使用することです。2つの交配タイプが2つの異なるアミノ酸に対して栄養要求性である場合、2つの交配タイプの融合によって形成された二倍体細胞のみが、両方のアミノ酸が不足している培地上で増殖することができる。したがって、栄養要求性マーカーは、定性的および定量的に交配を検出するのに有用である。減数分裂後の株の交配タイプを特定するには、定性的試験で十分です¹⁶。定量的試験は、交配経路に関与する遺伝子を研究しながら交配の減少を特定することに関心がある場合に不可欠です^17,18。さらに、酵母が種分化研究でますます使用されるようになるにつれて、交配効率の定量化は前接合体バリアの尺度であるため、便利で再現性のある交配アッセイが必要です。

2つの酵母交配タイプ間の交配効率は、以前に定量化されています^16、19、20。以前に使用された方法のほとんどは、いくつかのバリエーション¹⁶、^21、22、^23、24、25で設計が似ています。それらのいくつかは初期の対数期培養を使用し、他のいくつかは一倍体株の中期対数期の培養を使用します。2つの交配タイプが混在する比率にはばらつきがあります。ほとんどすべてのプロトコルはニトロセルロースメンブレンを使用しています。以前に成長させた培養物から採取した両方の交配タイプの懸濁液を混合し、YPDプレート上に置いたニトロセルロース膜上で濾過する。プロトコルの変形例の1つでは、一倍体懸濁液は、YPDプレート²¹に直接パッチが当てられる。2つの交配タイプのフェロモン産生に関与する遺伝子を扱う実験では、2つの交配タイプの懸濁液を作りながらフェロモンを外部から添加します²⁴。

一倍体を混合した後、数時間(典型的には約5時間)インキュベーションした後、細胞を膜から洗い流し、希釈し、選択培地に播種する。1973年に報告された以前の方法の1つでは、接合子形成または交配の効率は、血球計算盤²⁶を使用して顕微鏡下で出芽細胞、未出芽細胞、および交配ペアの数をカウントすることによって計算された。しかし、後に報告されたほとんどの方法は、一倍体と二倍体を区別するために栄養要求性マーカーを使用しています。交配効率は、細胞プール^16、21、23における二倍体および一倍体細胞の数に対する二倍体細胞の割合として計算される。

しかし、種分化を研究するためのモデル生物として酵母を用いた多くの報告があるにもかかわらず、交配の効率を計算するための標準化されたプロトコルはこれまで文献で報告されていない。対数相の細胞は、交配効率の定量化には理想的ではない可能性があります。交配中、2倍体の細胞周期は停止するため、交尾中の細胞は^{分裂していません9}。細胞周期が固定相²⁷の細胞において同様に停止されることも知られているので、そのような細胞を使用することは、プロトコルをより再現性のあるものにすることができる。固定相細胞を混合し、交配のためにYPDプレート(すなわち、栄養的に豊富な環境)上に配置することができる。従来の手順では、ニトロセルロース膜と細胞の洗浄も必要であり、プロセスが煩雑で取り扱いエラーが発生しやすくなります。さらに、これまでに使用されたプロトコルは、1倍体の観点から交配効率を定量化します。ただし、生殖隔離を測定する場合、交配効率は、単一の一倍体ではなく、一倍体の特定の組み合わせについて定量化されます。

これらの課題を解決するため、本稿では、酵母の交配効率を再現性が高く、使いやすい堅牢な定量法について報告する。さらに、この方法とここで採用されている酵母株は、交配障壁の進化に対する遺伝子流動の影響を調べる研究にも使用できます。

この研究では、S. cerevisiaeの2つの異なる株が使用されました。株の1つはSK1バックグラウンドに由来します。これは、MAT遺伝子座の近くに栄養要求性マーカーを追加することによって私たちの研究室で修正されました。得られたハプロイドの遺伝子型を表^{128、29、30}に提供する。SK1株では、一倍体はMAT遺伝子座の近くにTRP1遺伝子が挿入され、α半数体はMAT遺伝子座の近くにLEU2遺伝子が挿入されていました。ScAM株では、TRP1遺伝子とURA3遺伝子がそれぞれaとαの一倍体に挿入されていました。挿入位置は第III染色体のARS領域(Chr III:197378..197609)であった。ここで報告されたプロトコルでは、ゲノム上の任意の場所に栄養要求性マーカーで十分です。しかし、MAT遺伝子座の近くに栄養要求性マーカーを有するということは、これらの株が種分化に対する遺伝子流動の影響を調べる研究にも使用できることを意味する^31,32。マーカーは、組換えによるマーカーの再シャッフルを防ぐために、MAT遺伝子座の近くに追加されました。したがって、このプロトコルは、種分化を含む研究における交配効率を定量化するために、また交配経路に関与するタンパク質を研究する際の交配効率の変化を特定するために使用することができます。

Protocol

注:プロトコルには、(1)YPDプレート上の嵌合効率グリッドのハプロイドにパッチを当てる、(2)24時間のインキュベーション後に一倍体を等数で混合し、混合ハプロイドを数時間交配させる(この研究では7時間)、(3)混合細胞をYPDにプレーティングして、30°Cで7時間後に単一コロニーを単離する、 そして最後に、(4)栄養要求性マーカーを用いて形成される二倍体の数を決定する。これらの手順につ…

Representative Results

2種類の嵌合効率の定量化ここで説明したプロトコルを使用して、2つの酵母株間(SK1AM aとSK1AMαの間、およびScAMaとScAMαの間の交配効率を定量化しました(図3A)。これらの実験では、2つの一倍体間の交配を少なくとも12回繰り返した。実験の繰り返しのそれぞれにおいて、少なくとも100個のコロニーが二重ド…

Discussion

S. cerevisiaeの交配効率の定量化は、交配経路に関与する遺伝子に関する研究や、交配行動に対する外部環境の影響を研究するために不可欠です。過去20年間で、S. cerevisiaeは種分化に関連する質問に対処するための人気のあるモデルにもなりました14,36,37,38。2つの交配タイプの存在と、…

Materials

Adenine	Sigma Life Science	A8626
Agar Powder regular grade for bacteriology	SRL	19661 (0140186)
Ammonium Sulphate, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-glucose	Sigma Life Science	G8270
Glass Petri plates	HiMedia	PW008	90 mm x 15 mm dimension
L-Arginine	Sigma Life Science	A8094
L-Aspartic acid	Sigma Life Science	A7219
L-Histidine monochloride monohydrate	Sigma Life Science	H5659
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Life Science	L8912
L-Lysine	Aldrich	62840
L-Methionine	Sigma Life Science	M5308
L-Phenylalanine	Sigma Life Science	P5482
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tyrosine	Sigma Life Science	T8566
L-Valine	Sigma Life Science	V0513
Mating efficiency grid			1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate
Microcentrifuge tubes	Tarsons	500010
Peptone	HiMedia	RM001
Uracil	Sigma Life Science	U0750
Yeast Extract Powder	HiMedia	RM027
Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate	BD Difco	233520