Protection des cellules myocardiques H9c2 contre le stress oxydatif par la crocétine via la mitophagie médiée par la voie PINK1/Parkin

Summary

Basée sur des expériences in vitro , cette étude a révélé le mécanisme de la crocétine dans la réparation des dommages causés par le stress oxydatif des cardiomyocytes en influençant la mitophagie, dans laquelle la voie de signalisation PINK1 / Parkin joue un rôle important.

Abstract

Cette étude visait à explorer l’effet protecteur contre le stress oxydatif de la crocétine sur les cellules myocardiques H9c2 médiées_{par H2}O₂ par le biais d’expériences in vitro, et à explorer davantage si son mécanisme est lié à l’impact de la mitophagie. Cette étude visait également à démontrer l’effet thérapeutique de l’acide carthame sur le stress oxydatif dans les cardiomyocytes et à explorer si son mécanisme est lié à l’effet de la mitophagie. Ici, un modèlede stress oxydatif basé sur H 2 O₂ a été construit et a évalué le degré de lésion de stress oxydatif des cardiomyocytes en détectant les niveaux de lactate déshydrogénase (LDH), de créatine kinase (CK), de malondialdéhyde (MDA), de superoxyde dismutase (SOD), de catalase (CAT) et de glutathion peroxydase (GSH Px). Le colorant fluorescent DCFH-DA, JC-1 et TUNEL ont été utilisés pour évaluer les dommages mitochondriaux et l’apoptose. Le flux autophagique a été mesuré par transfectation de l’adénovirus Ad-mCherry-GFP-LC3B. Des protéines liées à la mitophagie ont ensuite été détectées par transfert Western et immunofluorescence. Cependant, la crocétine (0,1-10 μM) pourrait améliorer considérablement la viabilité cellulaire et réduire l’apoptose et les dommages causés par le stress oxydatif causés par _H2O2. Dans les cellules à activation autophagique excessive, la crocétine pourrait également réduire le flux d’autophagie et l’expression des protéines liées à la mitophagie PINK1 et Parkin, et inverser le transfert de Parkin aux mitochondries. La crocétine pouvait réduire les dommages causés par le stress oxydatif médié par H2O₂ et l’apoptose des cellules H9c2, et son mécanisme était étroitement lié à la mitophagie.

Introduction

L’infarctus aigu du myocarde (IAM) est une nécrose myocardique potentiellement mortelle causée par une ischémie et une hypoxie sévères et persistantes des artères coronaires ^1,2. L’intervention coronarienne percutanée (ICP) est l’une des stratégies thérapeutiques de première intention pour l’IAM et protège généralement les cardiomyocytes contre les lésions ischémiques ^3,4. Le myocarde distal manquera d’apport de sang et d’oxygène s’il n’est pas traité rapidement et efficacement après un IAM, ce qui entraîne une nécrose ischémique et d’autres complications cardiovasculaires ^5,6. La promotion de la récupération des cardiomyocytes et la minimisation des lésions myocardiques irréversibles après avoir manqué l’opportunité chirurgicale PCI ont été un point chaud de la recherche. Après IAM, les cardiomyocytes sont dans un état d’ischémie et d’hypoxie, ce qui entraîne l’inhibition de la phosphorylation oxydative mitochondriale, la réduction du NAD+ en NADPH et l’augmentation de la réduction d’un seul électron⁷. En conséquence, la réaction de réduction incomplète de l’oxygène génère un excès d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et conduit finalement à des dommages de stress oxydatif aux cardiomyocytes⁸. Une accumulation excessive de ROS déclenche une peroxydation lipidique, perturbant davantage la structure et la fonction des membranes mitochondriales. Le résultat est une ouverture continue des pores de transition de perméabilité mitochondriale et une diminution du potentiel de la membrane mitochondriale, induisant l’apoptose et la nécrose.

Les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ECA), les antagonistes des récepteurs de l’angiotensine (ARA), les inhibiteurs des récepteurs β-adrénergiques, les antagonistes de l’aldostérone et d’autres médicaments standard dans l’IAM peuvent aider à améliorer la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde et prévenir l’apparition d’événements malins, tels que les arythmies et le remodelage ventriculaire gauche⁹. Cependant, la survie et le pronostic post-infarctus sont grandement affectés par la taille de l’infarctus, et des résultats satisfaisants n’ont pas été obtenus pour réduire l’apoptose des cardiomyocytes^10,11. Ainsi, le développement de médicaments pour favoriser la récupération des cardiomyocytes après un infarctus du myocarde est devenu un problème urgent.

La médecine traditionnelle est une source d’inspiration pour la recherche pharmaceutique moderne depuis de nombreuses années^12,13,14,15. La médecine traditionnelle chinoise (MTC) a une longue histoire dans le traitement de l’IAM, et une série d’essais contrôlés randomisés au cours des dernières années ont confirmé que la MTC peut effectivement améliorer le pronostic des patients^16,17. Selon la théorie de la MTC, l’IAM est causée par la stase sanguine^18,19, de sorte que les médicaments pour favoriser la circulation sanguine sont généralement utilisés pour le traitement de l’IAM dans la phase aiguë²⁰. Parmi eux, le safran est censé avoir un effet puissant sur l’activation sanguine et la stase, et est souvent utilisé dans le traitement aigu de l’IAM. La crocétine, un composant majeur du safran, pourrait jouer un rôle clé dans la protection des cardiomyocytes²¹.

Dans cette étude, les cellules myocardiques H9c2 ont été induitespar H 2 O₂ pour simuler l’ischémie / reperfusion myocardique, qui provoque une lésion cardiomyocytaire de l’IAM, et la crocétine a été utilisée comme intervention pour étudier son effet protecteur contre les lésions myocardiques induites par le stress oxydatif. Le mécanisme de la crocétine protégeant les cardiomyocytes a été exploré plus avant par mitophagie. Plus important encore, cet article fournit une référence pour l’approche technique de l’étude de la mitophagie et décrit l’ensemble de la procédure expérimentale en détail.

Protocol

Les expériences ont été réalisées au laboratoire de physiologie de l’Université de médecine chinoise de Pékin, en Chine. Toutes les méthodes d’étude ont été réalisées conformément aux directives et règlements pertinents de l’Université de Beijing. 1. Culture cellulaire Ajouter 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine au milieu basique Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco (avec 4,5 g/L de D-glucose, 4,g/L de L-glutamine et 1…

Representative Results

Effets de la crocétine sur la viabilité cellulaireLa crocétine à 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM et 100 μM avait un effet prolifératif significatif sur les cellules, tandis que la crocétine à des concentrations supérieures à 200 μM inhibait significativement la prolifération des cellules H9c2 (Figure 1A). Après 4 h de traitement avec 400 μMH2O2, la viabilité cellulaire a été considérablement réduite, et la crocétin…

Discussion

L’exploration d’ingrédients efficaces à partir de composés complexes de médicaments naturels grâce à une technologie de pointe a été un point chaud de la recherche en MTC²⁹ et peut fournir des preuves de laboratoire pour le développement futur de médicaments après vérification. Le carthame est un médicament représentatif dans le traitement de « favoriser la circulation sanguine et de minimiser la stase sanguine » et est largement utilisé dans le traitement de l’infarctus d…

Materials

0.25% trypsin	Gibco	2323363
1% Penicillin-streptomycin	Sigma	V900929
5x protein loading buffer	Beijing Pulilai Gene Technology	B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus	Beyotime	C3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZF-0513
Animal-free blocking solution	CST	15019s
Anti-Parkin antibody	Santa Cruz	sc-32282
Anti-PINK1 antibody	ABclonal	A11435
Anti-TOM20 antibody	ABclonal	A19403
Anti-β-actin  antibody	ABclonal	AC026
BCA protein assay kit	KeyGEN Biotech	KGP902
Blood cell counting plate	Servicebio	WG607
CAT assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1
Chemiluminescence detection system	Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory	ChemiScope 6100
CK assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10)	Macklin	C6129
Crocetin	Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.	RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9557
DCFH-DA	Beyotime	S0033S
DMSO	Solarbio	D8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution	NCM Biotech	P10100
Fetal bovine serum (FBS)	Corning-Cellgro	35-081-CV
GraphPad Prism 7.0	https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A005-1-2
H9c2 myocardial cells	Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.	CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit	LABLEAD	J22202
LDH assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A020-2-2
MDA assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A003-2-2
Methanol	Aladdin	A2114057
MTS assay	Promega	G3581
Perhydrol	G-clone	CS7730
Phosphatase inhibitor	CWBIO	CW2383
Polybrene	Beyotime	C0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes	Millipore	ISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer	Solarbio	R0010
SDS-PAGE gels	Shanghai Epizyme Biomedical Technology	PG112
SDS-PAGE running buffer powder	Servicebio	G2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powder	Servicebio	G2017-1L
SOD assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-2-2
Tris-buffered saline powder	Servicebio	G0001-2L
Triton X-100	Sigma	SLCC9172
TUNEL apoptosis assay kit	Beyotime	C1086
Tween-20	Solarbio	T8220