İn vitro deneylere dayanarak, bu çalışma, PINK1 / Parkin sinyal yolunun önemli bir rol oynadığı mitopajiyi etkileyerek kardiyomiyositlerin oksidatif stres hasarını onarmada krosetinin mekanizmasını ortaya koymuştur.
Bu çalışma, krosetininH2O2 aracılı H9c2miyokard hücreleri üzerindeki oksidatif stresten koruyucu etkisini in vitro deneylerle araştırmayı ve mekanizmasının mitopajinin etkisiyle ilişkili olup olmadığını araştırmayı amaçlamıştır. Bu çalışmada ayrıca aspir asidinin kardiyomiyositlerde oksidatif stres üzerine terapötik etkisinin gösterilmesi ve mekanizmasının mitopajinin etkisi ile ilişkili olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. Burada, birH2O2bazlı oksidatif stres modeli oluşturulmuş ve laktat dehidrogenaz (LDH), kreatin kinaz (CK), malondialdehit (MDA), süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT) ve glutatyon peroksidaz (GSH Px) seviyelerini tespit ederek kardiyomiyositlerin oksidatif stres hasarının derecesini değerlendirmiştir. Mitokondriyal hasarı ve apoptozu değerlendirmek için reaktif oksijen türleri (ROS) tespit eden floresan boya DCFH-DA, JC-1 boyası ve TUNEL boyası kullanıldı. Otofajik akı Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirüs transfekte edilerek ölçüldü. Mitopaji ile ilişkili proteinler daha sonra batı lekelenmesi ve immünofloresan yoluyla tespit edildi. Bununla birlikte, krosetin (0.1-10 μM) hücre canlılığını önemli ölçüde artırabilir veH2O2’nin neden olduğu apoptozve oksidatif stres hasarını azaltabilir. Aşırı otofajik aktivasyonu olan hücrelerde, krosetin ayrıca otofaji akışını ve mitopaji ile ilişkili proteinler PINK1 ve Parkin’in ekspresyonunu azaltabilir ve Parkin’in mitokondriye transferini tersine çevirebilir. Krosetin,H2O2aracılı oksidatif stres hasarını ve H9c2 hücrelerinin apoptozunu azaltabilir ve mekanizması mitopaji ile yakından ilişkiliydi.
Akut miyokard enfarktüsü (), koroner arterlere şiddetli ve inatçı iskemi ve hipoksi sonucu ortaya çıkan, hayatı tehdit eden bir miyokard nekrozudur 1,2. Perkütan koroner girişim (PKG), için birinci basamak terapötik stratejilerden biridir ve genellikle kardiyomiyositleri iskemik hasardan korur 3,4. Distal miyokard, sonrası derhal ve etkili bir şekilde tedavi edilmezse kan ve oksijen kaynağından yoksun kalacaktır, bu da iskemik nekroza ve daha ileri kardiyovasküler komplikasyonlara yol açacaktır 5,6. Kardiyomiyosit iyileşmesini teşvik etmek ve PCI cerrahi fırsatını kaçırdıktan sonra geri dönüşümsüz miyokard hasarını en aza indirmek bir araştırma noktası olmuştur. AMI’den sonra, kardiyomiyositler iskemi ve hipoksi durumundadır, bu da mitokondriyal oksidatif fosforilasyonun inhibisyonu, NAD + ‘nın NADPH’ye indirgenmesi ve tek elektron redüksiyonunun artmasıile sonuçlanır 7. Sonuç olarak, oksijenin eksik indirgeme reaksiyonu, aşırı miktarda reaktif oksijen türü (ROS) üretir ve sonuçta kardiyomiyositlerde oksidatif stres hasarına yol açar8. Aşırı ROS birikimi, lipit peroksidasyonunu tetikleyerek mitokondriyal membranların yapısını ve işlevini daha da bozar. Sonuç, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin sürekli açılması ve mitokondriyal membran potansiyelinde bir azalma, apoptoz ve nekrozu indüklemesidir.
Anjiyotensin dönüştürücü enzim (ACE) inhibitörleri, anjiyotensin reseptör blokerleri (ARB’ler), β-adrenoseptörlerin inhibitörleri, aldosteron antagonistleri ve’deki diğer standart ilaçlar, miyokard enfarktüsünden sonra kalp fonksiyonlarını iyileştirmeye yardımcı olabilir ve aritmiler ve sol ventrikül yeniden şekillenmesi gibi malign olayların ortaya çıkmasını önleyebilir9. Bununla birlikte, enfarktüs sonrası sağkalım ve prognoz enfarktüs boyutundan büyük ölçüde etkilenmektedir ve kardiyomiyosit apoptozunu azaltmada tatmin edici sonuçlar elde edilememiştir10,11. Bu nedenle, miyokard enfarktüsünden sonra kardiyomiyosit iyileşmesini teşvik etmek için ilaçların geliştirilmesi acil bir konu haline gelmiştir.
Geleneksel tıp, uzun yıllardır modern farmasötik araştırmalar için bir ilham kaynağı olmuştur12,13,14,15. Geleneksel Çin tıbbı (TCM), tedavisinde uzun bir geçmişe sahiptir ve son yıllarda yapılan bir dizi randomize kontrol çalışması, TCM’nin hastaların prognozunu gerçekten iyileştirebileceğini doğrulamıştır16,17. TCM teorisine göre,’ye kan stazı18,19 neden olur, bu nedenle kan dolaşımını teşvik eden ilaçlar genellikle akut faz20’de tedavisi için kullanılır. Bunlar arasında safranın kan aktivasyonu ve stazı üzerinde güçlü bir etkisi olduğuna inanılmaktadır ve sıklıkla’nin akut tedavisinde kullanılmaktadır. Safranın önemli bir bileşeni olan krosetin, kardiyomiyositlerin korunmasında önemli bir rol oynayabilir21.
Bu çalışmada, H9c2 miyokard hücreleri,’nin kardiyomiyosit hasarına neden olan miyokard iskemisi / reperfüzyonunu simüle etmek için H2O2tarafından indüklendi ve oksidatif strese bağlı miyokard hasarına karşı koruyucu etkisini araştırmak için bir müdahale olarak krosetin kullanıldı. Krosetinin kardiyomiyositleri koruma mekanizması mitopaji ile daha da araştırıldı. Daha da önemlisi, bu makale mitopaji çalışmasına teknik yaklaşım için bir referans sağlar ve tüm deneysel prosedürü ayrıntılı olarak açıklar.
İleri teknoloji ile doğal ilaçların karmaşık bileşiklerinden etkili bileşenlerin araştırılması, TCM araştırmasının29 sıcak noktası olmuştur ve doğrulamadan sonra gelecekteki ilaç gelişimi için laboratuvar kanıtları sağlayabilir. Aspir, “kan dolaşımını teşvik etmek ve kan durağanlığını en aza indirmek” tedavisinde temsili bir ilaçtır ve miyokard enfarktüsü tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır30,31<…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (No. 7202119) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82274380) tarafından desteklenmiştir.
0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
DMSO | Solarbio | D8371 | |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
Methanol | Aladdin | A2114057 | |
MTS assay | Promega | G3581 | |
Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
Polybrene | Beyotime | C0351 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
Tween-20 | Solarbio | T8220 |