PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy를 통한 Crocetin에 의한 산화 스트레스로부터 H9c2 심근 세포 보호
Summary
시험관 내 실험을 기반으로 한 이 연구는 PINK1/Parkin 신호 전달 경로가 중요한 역할을 하는 미토파지에 영향을 미쳐 심근 세포의 산화 스트레스 손상을 복구하는 크로세틴의 메커니즘을 밝혔습니다.
Abstract
본 연구는 체외 실험을 통해H2O2매개 H9c2 심근세포에 대한 크로세틴의 산화적 스트레스 보호 효과를 탐색하고, 그 기전이 미토파지의 영향과 관련이 있는지 여부를 추가로 탐색하는 것을 목표로 하였다. 이 연구는 또한 심근 세포의 산화 스트레스에 대한 홍화산의 치료 효과를 입증하고 그 메커니즘이 미토파지의 효과와 관련이 있는지 여부를 탐색하는 것을 목표로 했습니다. 여기서는H2O2기반 산화 스트레스 모델을 구축하고, 젖산 탈수소효소(LDH), 크레아틴 키나아제(CK), 말론디알데히드(MDA), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 카탈라아제(CAT), 글루타티온 퍼옥시다아제(GSH Px)의 수준을 검출하여 심근 세포의 산화 스트레스 손상 정도를 평가하였다. 활성 산소 종(ROS) 검출 형광 염료 DCFH-DA, JC-1 염료 및 TUNEL 염료를 사용하여 미토콘드리아 손상 및 세포자멸사를 평가했습니다. 자가포식 플럭스는 Ad-mCherry-GFP-LC3B 아데노바이러스를 형질감염시켜 측정하였다. 그런 다음 Mitophagy 관련 단백질을 웨스턴 블로팅 및 면역형광을 통해 검출했습니다. 그러나 크로세틴(0.1-10μM)은 세포 생존율을 크게 향상시키고H2O2로 인한 세포자멸사 및 산화 스트레스 손상을 감소시킬 수 있습니다. 자가포식 활성화가 과도한 세포에서 크로세틴은 자가포식 흐름과 미토파지 관련 단백질 PINK1 및 Parkin의 발현을 감소시키고 Parkin이 미토콘드리아로 전달되는 것을 역전시킬 수 있습니다. 크로세틴은H2O2매개 산화 스트레스 손상과 H9c2 세포의 세포자멸사를 감소시킬 수 있으며 그 메커니즘은 미토파지와 밀접한 관련이 있습니다.
Introduction
급성 심근경색증(Acute myocardial infarction, AMI)은 관상동맥에 대한 심각하고 지속적인 허혈 및 저산소증에 의해 유발되는 생명을 위협하는 심근 괴사이다 1,2. 경피적 관상동맥 중재술(PCI)은 AMI의 1차 치료 전략 중 하나이며, 일반적으로 허혈성 손상으로부터 심근세포를 보호한다 3,4. 원위 심근은 AMI 후 신속하고 효과적으로 치료하지 않으면 혈액과 산소 공급이 부족하여 허혈성 괴사와 심혈관 합병증을 유발합니다 5,6. PCI 수술 기회를 놓친 후 심근 세포 회복을 촉진하고 돌이킬 수 없는 심근 손상을 최소화하는 것은 연구 핫스팟이었습니다. AMI 후, 심근 세포는 허혈 및 저산소증 상태에 있으며, 그 결과 미토콘드리아 산화적 인산화가 억제되고, NAD+가 NADPH로 환원되며, 단일 전자 환원이 증가한다7. 그 결과, 산소의 불완전한 환원 반응은 과량의 활성산소종(ROS)을 생성하고, 궁극적으로 심근세포에 산화적 스트레스 손상을 일으킨다8. ROS의 과도한 축적은 지질 과산화를 유발하여 미토콘드리아 막의 구조와 기능을 더욱 방해합니다. 그 결과 미토콘드리아 투과성 전이 기공이 지속적으로 열리고 미토콘드리아 막 전위가 감소하여 세포 사멸과 괴사가 유도됩니다.
안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제, 안지오텐신 수용체 차단제(ARB), β-아드레날린 수용체 억제제, 알도스테론 길항제 및 기타 표준 약물인 AMI는 심근경색 후 심장 기능을 향상시키고 부정맥 및 좌심실 리모델링과 같은 악성 사건의 발생을 예방하는 데 도움이 될 수 있다9. 그러나, 경색 후 생존율 및 예후는 경색 크기에 의해 크게 영향을 받으며, 심근세포 아폽토시스를 감소시키는 것에 대한 만족스러운 결과는 달성되지 않았다10,11. 따라서, 심근경색 후 심근세포 회복을 촉진하는 약물의 개발이 시급한 이슈가 되고 있다.
전통 의학은 수년 동안 현대 제약 연구에 영감의 원천이었습니다12,13,14,15. 중국 전통 의학(TCM)은 AMI 치료에 오랜 역사를 가지고 있으며, 최근 몇 년 동안 일련의 무작위 대조 시험을 통해 TCM이 실제로 환자의 예후를 개선할 수 있음을 확인했습니다16,17. TCM 이론에 따르면, AMI는 혈액 정체18,19에 의해 발생하므로 혈액 순환을 촉진하는 약물은 일반적으로 급성기20의 AMI 치료에 사용됩니다. 그 중 사프란은 혈액 활성화와 정체에 강력한 효과가 있는 것으로 여겨지며 AMI의 급성 치료에 자주 사용됩니다. 사프란의 주요 성분인 크로세틴은 심근 세포를 보호하는 데 중요한 역할을 할 수 있다21.
이 연구에서는 H9c2 심근 세포를 H2O2 에 의해 유도하여 AMI의 심근 세포 손상을 유발하는 심근 허혈/재관류를 시뮬레이션하고, 산화 스트레스 유발 심근 손상에 대한 보호 효과를 조사하기 위한 중재로 크로세틴을 사용했습니다. 심근 세포를 보호하는 크로세틴의 메커니즘은 미토파지를 통해 추가로 탐구되었습니다. 더 중요한 것은 이 기사가 미토파지 연구에 대한 기술적 접근에 대한 참조를 제공하고 전체 실험 절차를 자세히 설명한다는 것입니다.
Protocol
실험은 중국 베이징 중의과 대학의 생리학 실험실에서 수행되었습니다. 모든 연구 방법은 베이징 대학의 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 1. 세포 배양 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 기본 배지(4.5g/L D-포도당, 4.g.g/L L-글루타민 및 110mg/L 피루브산나트륨 포함, 재료 표 참조)에 추가하?…
Representative Results
세포 생존율에 대한 크로세틴의 효과0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM 및 100 μM의 크로세틴은 세포에 상당한 증식 효과를 보인 반면, 200 μM 이상의 농도에서 크로세틴은 H9c2 세포의 증식을 유의하게 억제했습니다(그림 1A). 400 μM H 2 O2로 4 시간 처리 한 후, 세포 생존율은 상당히 감소되었고, 크로세틴은 이러한 변화를 어느 정도 되돌릴 수 있?…
Discussion
첨단 기술을 통해 천연 약물의 복잡한 화합물에서 유효 성분을 탐색하는 것은 TCM 연구29의 핫스팟이었으며 검증 후 향후 약물 개발을 위한 실험실 증거를 제공할 수 있습니다. 홍화는 “혈액 순환을 촉진하고 혈액 정체를 최소화하는”치료의 대표적인 약물이며 심근 경색 치료에 널리 사용됩니다30,31. 사프란은 홍화와 유사한 효과가 있?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 베이징 자연 과학 재단 (No. 7202119)과 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 82274380)의 지원을 받았다.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
Referencias
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
- Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
- Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
- Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
- Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
- Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
- La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
- De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
- Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
- Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
- Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
- Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
- Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
- Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
- Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
- Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
- Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
- Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
- Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
- Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
- Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
- Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
- Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
- Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
- Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
- Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
- Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
- Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
- Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
- Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
- Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
- Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
- Gan, Z. Y., et al. Activation mechanism of PINK1. Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).
- Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy. Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).
- Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
Citar este artículo
Chen, J., Li, Y., Zhang, Y., Du, T., Lu, Y., Li, X., Guo, S. Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy. J. Vis. Exp. (195), e65105, doi:10.3791/65105 (2023).