Защита клеток миокарда H9c2 от окислительного стресса кроцетином с помощью митофагии, опосредованной путем PINK1 / Parkin
Summary
Основываясь на экспериментах in vitro , это исследование выявило механизм кроцетина в восстановлении окислительного стрессового повреждения кардиомиоцитов путем влияния на митофагию, в которой важную роль играет сигнальный путь PINK1 / Parkin.
Abstract
Это исследование было направлено на изучение окислительного стресс-защитного эффекта кроцетина наH2O2-опосредованные клетки миокарда H9c2 с помощью экспериментов in vitro и дальнейшее изучение того, связан ли его механизм с воздействием митофагии. Это исследование также было направлено на демонстрацию терапевтического эффекта сафлоровой кислоты на окислительный стресс в кардиомиоцитах и изучение того, связан ли ее механизм с эффектом митофагии. Здесь была построена модель окислительного стресса на основе H 2 O2и оценена степень повреждения кардиомиоцитов окислительным стрессом путем определения уровней лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы (CK), малонового диальдегида (MDA), супероксиддисмутазы (SOD), каталазы (CAT) и глутатионпероксидазы (GSH Px). Для оценки повреждения митохондрий и апоптоза использовались флуоресцентные красители DCFH-DA, JC-1 и TUNEL, детектирующие активные формы кислорода (АФК). Аутофагический поток измеряли путем трансфицирования аденовируса Ad-mCherry-GFP-LC3B. Затем белки, связанные с митофагией, были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции. Однако кроцетин (0,1-10 мкМ) может значительно улучшить жизнеспособность клеток и уменьшить апоптоз и повреждение окислительным стрессом, вызванноеH2O2. В клетках с чрезмерной аутофагической активацией кроцетин также может уменьшать поток аутофагии и экспрессию связанных с митофагией белков PINK1 и Parkin, а также обращать вспять перенос паркина в митохондрии. Кроцетин может уменьшить H2O2-опосредованное окислительное стрессовое повреждение и апоптоз клеток H9c2, и его механизм был тесно связан с митофагией.
Introduction
Острый инфаркт миокарда (ОИМ) представляет собой опасный для жизни некроз миокарда, вызванный тяжелой и стойкой ишемией и гипоксией коронарных артерий 1,2. Чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ) является одной из терапевтических стратегий первой линии при ОИМ и обычно защищает кардиомиоциты от ишемического повреждения 3,4. Дистальный отдел миокарда будет лишен кровоснабжения и снабжения кислородом, если его своевременно и эффективно не лечить после ОИМ, что приводит к ишемическому некрозу и дальнейшим сердечно-сосудистым осложнениям 5,6. Содействие восстановлению кардиомиоцитов и минимизация необратимого повреждения миокарда после упущения возможности хирургического вмешательства ЧКВ было горячей точкой исследований. После ОИМ кардиомиоциты находятся в состоянии ишемии и гипоксии, что приводит к ингибированию митохондриального окислительного фосфорилирования, восстановлению НАД+ до НАДФН и увеличению восстановления одиночных электронов7. В результате неполная реакция восстановления кислорода порождает избыток активных форм кислорода (АФК) и в конечном итоге приводит к повреждению кардиомиоцитов окислительным стрессом8. Чрезмерное накопление АФК вызывает перекисное окисление липидов, еще больше нарушая структуру и функцию митохондриальных мембран. Результатом является непрерывное открытие переходных пор митохондриальной проницаемости и снижение мембранного потенциала митохондрий, индуцируя апоптоз и некроз.
Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), блокаторы ангиотензин-рецепторов (БРА), ингибиторы β-адренорецепторов, антагонисты альдостерона и другие стандартные препараты при ОИМ могут помочь улучшить функцию сердца после инфаркта миокарда и предотвратить возникновение злокачественных событий, таких как аритмии и ремоделирование левого желудочка9. Однако на постинфарктную выживаемость и прогноз сильно влияют размеры инфаркта, и удовлетворительных результатов по снижению апоптоза кардиомиоцитов10,11 достигнуто не было. Таким образом, разработка препаратов, способствующих восстановлению кардиомиоцитов после инфаркта миокарда, стала актуальным вопросом.
Традиционная медицина уже много лет является источником вдохновения для современных фармацевтических исследований12,13,14,15. Традиционная китайская медицина (ТКМ) имеет долгую историю лечения ОИМ, и серия рандомизированных контрольных исследований в последние годы подтвердила, что ТКМ действительно может улучшить прогноз пациентов16,17. Согласно теории ТКМ, ОИМ вызывается застоем крови18,19, поэтому препараты для улучшения кровообращения обычно используются для лечения ОИМ в острой фазе20. Среди них считается, что шафран оказывает мощное влияние на активацию крови и застой и часто используется при остром лечении ОИМ. Кроцетин, основной компонент шафрана, может играть ключевую роль в защите кардиомиоцитов21.
В этом исследовании клетки миокарда H9c2 были индуцированыH2O2 для имитации ишемии / реперфузии миокарда, которая вызывает повреждение кардиомиоцитов ОИМ, а кроцетин использовался в качестве вмешательства для исследования его защитного эффекта против повреждения миокарда, вызванного окислительным стрессом. Механизм защиты кардиомиоцитов кроцетином был дополнительно изучен с помощью митофагии. Что еще более важно, эта статья дает ссылку на технический подход к изучению митофагии и подробно описывает всю экспериментальную процедуру.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследование эффективных ингредиентов из сложных соединений природных лекарств с помощью передовых технологий было горячей точкой исследований ТКМ29 и может предоставить лабораторные данные для будущей разработки лекарств после проверки. Сафлор является репрезентатив?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Пекинским фондом естественных наук (No 7202119) и Национальным фондом естественных наук Китая (No 82274380).
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
Referencias
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
- Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
- Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
- Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
- Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
- Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
- La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
- De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
- Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
- Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
- Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
- Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
- Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
- Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
- Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
- Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
- Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
- Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
- Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
- Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
- Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
- Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
- Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
- Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
- Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
- Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
- Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
- Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
- Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
- Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
- Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
- Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
- Gan, Z. Y., et al. Activation mechanism of PINK1. Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).
- Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy. Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).
- Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
