使用电动设备对组织进行机械解离以进行单细胞分析
Summary
提供了组织结合酶法和半自动机械解离以产生用于下游分析（例如流式细胞术）的单细胞悬浮液的通用方案。包括为该协议开发的低成本机械装置的制造、组装和操作说明。
Abstract
能够分离和制备用于分析组织样本的单细胞对于新的生物医学发现和研究迅速变得至关重要。单细胞分离的手动方案非常耗时，并且容易出现用户差异。自动化机械方案能够减少处理时间和样品变异性，但在资源匮乏的研究环境中不容易获得或具有成本效益。这里描述的设备是为使用市售材料进行半自动组织解离而设计的，作为学术实验室的低成本替代品。提供了制造、组装和操作设备设计的说明。该解离方案可靠地产生单细胞悬浮液，其细胞产量和样品活力与跨多个小鼠组织的手动制备相当。该方案能够为每台设备同时处理多达 12 个组织样本，使需要大样本量的研究更易于管理。随附的软件还允许自定义设备协议，以适应不同的组织和实验限制。
Introduction
无论是流式细胞术、识别不同细胞类型、单细胞测序，还是用于识别细胞之间的基因组或转录组变异，单细胞分析都已迅速成为新的生物医学发现的关键1。从感兴趣的组织中进行这种细胞分离需要切碎解剖的组织并将它们推入细细胞过滤器，以从所需细胞中过滤掉结缔组织（图1A）。分离贴壁细胞类型，例如树突状细胞或巨噬细胞，或来自特定纤维组织的细胞，需要额外的机械或酶分离步骤2,3,4。该过程通常是手动完成的，因此在评估细胞产量和样品活力时非常耗时且容易出现用户差异。因此，引入可定制的自动组织解离选项至关重要。虽然已经对设计此类系统进行了一些尝试，但现有的选项并不总是容易获得，特别是在学术实验室和资源匮乏的环境中，这主要是由于这些设备的成本过高5.此外，这些设备并不总是可以根据研究小组的个性化需求进行定制 6.
在这里，设计了一种组织解离装置，用于在消化酶和机械破坏的帮助下将整个组织或组织块自动消化成单细胞悬浮液。该设备可以在实验室中轻松组装，放入加热或冷却室中进行温度调节，根据所需数量的解离组织进行定制，并使用所需的解离方案进行编程。该装置的广泛使用可以显着提高细胞提取方案的可重复性，并提供一种节省时间的手动解离替代方案。
该设计允许通过自动化过程同时消化多达 12 个组织。该设备由 12 个并联的独立电机组成，并通过带有可调电压刻度盘的 AC/DC 适配器由标准壁式插头供电，以控制电机的旋转/速度。电机转动一个紧贴 C 型管顶部的六角螺栓。C型管通过亚克力板上的向下张力固定到位，亚克力板在两侧锁定在固定电机的顶板上（图1B）。由于电机是并联接线的，因此它们在任何给定电压下的速度变化不大，但即使电压保持恒定，负载（安装在设备上的 C 管数量）也会影响速度。为了测量每分钟转数 （rpm），在其中一个电机轴上安装了使用霍尔效应传感器和固定磁铁的转速计（补充图 1）。用于构建电机阵列的 CAD 文件在 补充编码文件 1 中提供。还包括一个可编程开关，通过反转传递到电机的正/负电荷来反转旋转方向。所有这些功能都使用编码软件（Arduino IDE软件，请参阅 材料表）集成在Arduino Nano（补充编码文件2）上。使用连接的按钮和 LCD 面板（补充图 2），可以创建和运行保存的和自定义的协议，在协议的指定时间自动反转旋转方向，使用电压调整速度（补充图 3），并显示当前电机速度和完成编程协议的剩余时间（补充图 4）。
在本研究中，使用该装置的机械-酶促组织解离和手动酶促组织解离制备单细胞悬浮液，以确定为下游应用回收的细胞中的差异（如果有的话）。根据每个组织的总细胞产量和细胞活力百分比评估细胞制剂。流式细胞术用于比较表面标志物表达的潜在差异。使用图形和统计分析软件对数据进行分析。使用未配对的 Welch t 检验 来比较成对的样本或组，样本量 n > 4 只小鼠代表 2 个重复实验。有关制造和组装此设备的详细说明，请参阅 补充文件 1。该协议所需的材料列在 材料表中。
Protocol
Representative Results
Discussion
该设备设计用于在研究环境中轻松组装，以提供来自整个组织的单细胞悬浮液，用于随后的单细胞分析。这些功能虽然很基本，但足以满足学术环境及其他环境中的研究人员的需求。使用该装置的一个主要优点是它有可能通过减少变异性来改进单细胞悬浮液的制备。此外，同时处理 12+ 个样品的能力可以提高样品间的一致性，这可能会受到手动解离方案所需时间增加的影响。在研究机构和行业环?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
资金来自 Fischell 生物工程系 （KM）、T32 GM080201 （MA）、Vogel 捐赠暑期奖学金 （MA）、LAM 基金会 （KM） 和美国肺脏协会 （KM）。作者要感谢米歇尔·卡卢津斯基（Michele Kaluzienski）在编辑方面的帮助。
Materials
| ¼ inch acrylic sheet 12" x 24" | Acrylic Mega Store | N/A | |
| ½ inch acrylic sheet 12" x 12" | SimbaLux | SL-AS13-12×12 | |
| 12 G stainless steel wire (for tension arms) | Everbilt | 1000847413 | |
| 16 G electrical wire (stranded) | Best Connections | N/A | |
| 2 x 3 mm magnet | SU-CRO0587 | N/A | |
| 2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors) | AEDIKO | AE06233 | |
| 37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12 | Greartisan | N/A | Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included) |
| AC/C Power Adapter with variable voltage controller (5 Amps, 3-12 volts) | Mo-gu | J19091-2-MG-US | |
| AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer | Walfront | 1A | (power adapter for powering Arduino Nano) |
| Arduino Nano (Lafvin) | LAFVIN | 8541582500 | |
| Buttons | Awpeye | Push-button | |
| C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | ||
| Collagenase 4 | Worthington | CLS4 LS004188 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse | Roche | 11284932001 | |
| Double sided foam tape | SANKA | N/A | |
| Double Sided prototyping circuit board | deyue | N/A | |
| EDTA | Sigma- Aldrich | E7889 | |
| Electrical solder and soldering iron | LDK | 1002P | |
| Electrical Tape | 3M | 03429NA | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 16140089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Graphpad Prism | GraphPad, La Jolla, CA | Graphing and statistical analysis software | |
| Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches | SunFounder | 43237-2 | |
| Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12 | Uxcell | N/A | |
| Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12 | FAS | N/A | |
| Jumper wires (for Arduino Nano) | ELEGOO | EL-CP-004 | |
| LCD screen | JANSANE | N/A | |
| M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12 | Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd |
310luosditaozhuang | |
| M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36 | Still Awake | a52400001 | |
| Quick disconnect terminal connectors | IEUYO | 22010064 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling | 46232 | |
| Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano 12" x 24" | Shenzhen Weiyapuhua Technology |
60-026-3 |
Referencias
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