Dissociação mecânica de tecidos para análise unicelular utilizando dispositivo motorizado
Summary
Um protocolo geral para a dissociação mecânica enzimática e semi-automatizada combinada de tecidos para gerar suspensões unicelulares para análises a jusante, como citometria de fluxo, é fornecido. Instruções para a fabricação, montagem e operação do dispositivo mecânico de baixo custo desenvolvido para este protocolo estão incluídas.
Abstract
Ser capaz de isolar e preparar células únicas para a análise de amostras de tecido tornou-se rapidamente crucial para novas descobertas e pesquisas biomédicas. Protocolos manuais para isolamentos de célula única são altamente demorados e propensos à variabilidade do usuário. Os protocolos mecânicos automatizados são capazes de reduzir o tempo de processamento e a variabilidade da amostra, mas não são facilmente acessíveis ou econômicos em ambientes de pesquisa com menos recursos. O dispositivo aqui descrito foi projetado para dissociação tecidual semi-automatizada usando materiais disponíveis comercialmente como uma alternativa de baixo custo para laboratórios acadêmicos. Instruções para fabricar, montar e operar o design do dispositivo foram fornecidas. O protocolo de dissociação produz suspensões de célula única de forma confiável com rendimentos celulares comparáveis e viabilidade de amostra para preparações manuais em vários tecidos de camundongos. O protocolo fornece a capacidade de processar até 12 amostras de tecido simultaneamente por dispositivo, tornando os estudos que exigem grandes tamanhos de amostra mais gerenciáveis. O software que o acompanha também permite a personalização do protocolo do dispositivo para acomodar tecidos variados e restrições experimentais.
Introduction
A análise unicelular tornou-se rapidamente crucial para novas descobertas biomédicas, seja para aplicações como citometria de fluxo, identificação de diferentes tipos celulares, sequenciamento unicelular, seja para identificar variações genômicas ou transcriptômicas entre células1. A realização desses isolamentos celulares a partir de tecidos de interesse requer a picagem de tecidos dissecados e empurrá-los através de um filtro de células finas para filtrar o tecido conjuntivo das células desejadas (Figura 1A). O isolamento de tipos celulares aderentes, como células dendríticas ou macrófagos, ou células de tecidos particularmente fibrosos, requer etapas adicionais de separação mecânica ou enzimática 2,3,4. Esse processo geralmente é feito manualmente, tornando-o altamente demorado e propenso à variabilidade do usuário ao avaliar o rendimento das células e a viabilidade da amostra. Portanto, é crucial introduzir opções personalizáveis para a dissociação automatizada de tecidos. Embora algumas tentativas tenham sido feitas para projetar tais sistemas, as opções existentes nem sempre são prontamente acessíveis, particularmente em laboratórios acadêmicos e ambientes com poucos recursos, em grande parte devido à natureza proibitiva de custo desses dispositivos5. Além disso, esses dispositivos nem sempre são personalizáveis às necessidades individuais de um grupo de pesquisa6.
Aqui, um dispositivo dissociador de tecido foi projetado para automatizar a digestão de tecidos inteiros ou pedaços de tecido em suspensões de célula única com a ajuda de enzimas digestivas e interrupção mecânica. Este dispositivo pode ser facilmente montado no laboratório, colocado em câmaras de aquecimento ou resfriamento para regulação de temperatura, personalizado para o número necessário de tecidos a dissociar e programado com os protocolos de dissociação desejados. O amplo uso desse dispositivo poderia melhorar significativamente a reprodutibilidade de protocolos de extração celular e fornecer uma alternativa de economia de tempo à dissociação manual.
O projeto permite a digestão simultânea de até 12 tecidos através de um processo automatizado. O dispositivo é composto por 12 motores individuais ligados em paralelo e alimentados por um plugue de parede padrão através de um adaptador AC / DC com um seletor de tensão ajustável para controlar a rotação / velocidade dos motores. Os motores giram um parafuso hexadecimal que se encaixa perfeitamente na parte superior dos tubos C. Os tubos em C são mantidos no lugar por tensão descendente em uma placa de acrílico que se prende de ambos os lados à placa superior onde os motores são fixados (Figura 1B). Como os motores são conectados em paralelo, sua velocidade em qualquer tensão não deve variar muito, mas a carga (o número de tubos C montados no dispositivo) afetará a velocidade mesmo quando a tensão for mantida constante. Para medir as rotações por minuto (rpm), um tacômetro foi incorporado usando um sensor de efeito hall e um ímã fixo em um dos eixos do motor (Figura Suplementar 1). Os arquivos CAD para a construção de matrizes de motor são fornecidos no Arquivo de Codificação Suplementar 1. Também está incluído um interruptor programável para inverter a direção da rotação, invertendo as cargas positivas/negativas entregues aos motores. Todos esses recursos são integrados usando software codificado (software Arduino IDE, consulte Tabela de Materiais) em um Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Usando botões conectados e um painel LCD (Figura 2 Suplementar), é possível criar e executar protocolos salvos e personalizados, inverter automaticamente a direção rotacional em horários especificados de um protocolo, ajustar a velocidade usando a tensão (Figura Suplementar 3) e exibir a velocidade atual do motor e o tempo restante para completar um protocolo programado (Figura 4 Suplementar).
Para o presente estudo, suspensões unicelulares foram preparadas usando dissociação tecidual mecânico-enzimática com este dispositivo e dissociação tecidual enzimático manual para determinar diferenças, se houver, em células recuperadas para aplicações a jusante. As preparações celulares foram avaliadas com base no rendimento total de células por tecido e na porcentagem de viabilidade celular. A citometria de fluxo foi utilizada para comparar possíveis diferenças na expressão de marcadores de superfície. Os dados foram analisados por meio de software de análise gráfica e estatística. Testes t de Welch não pareados foram usados para comparar pares de amostras ou grupos, com tamanhos amostrais n > 4 camundongos representando 2 experimentos replicados. Instruções detalhadas para a fabricação e montagem deste dispositivo podem ser encontradas no Arquivo Suplementar 1. Os materiais necessários para este protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este dispositivo foi projetado para fácil montagem no ambiente de pesquisa para fornecer suspensões de célula única de tecidos inteiros para posterior análise de célula única. Os recursos, embora básicos, são suficientes para atender às necessidades de pesquisadores em ambientes acadêmicos e além. Um dos principais benefícios do uso deste dispositivo é seu potencial para melhorar a preparação de suspensões de célula única, reduzindo a variabilidade. Além disso, a capacidade de processar 12+ amostras s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento foi recebido do Departamento de Bioengenharia Fischell (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Foundation (KM) e American Lung Association (KM). Os autores agradecem a Michele Kaluzienski pela ajuda na edição.
Materials
| ¼ inch acrylic sheet 12" x 24" | Acrylic Mega Store | N/A | |
| ½ inch acrylic sheet 12" x 12" | SimbaLux | SL-AS13-12×12 | |
| 12 G stainless steel wire (for tension arms) | Everbilt | 1000847413 | |
| 16 G electrical wire (stranded) | Best Connections | N/A | |
| 2 x 3 mm magnet | SU-CRO0587 | N/A | |
| 2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors) | AEDIKO | AE06233 | |
| 37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12 | Greartisan | N/A | Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included) |
| AC/C Power Adapter with variable voltage controller (5 Amps, 3-12 volts) | Mo-gu | J19091-2-MG-US | |
| AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer | Walfront | 1A | (power adapter for powering Arduino Nano) |
| Arduino Nano (Lafvin) | LAFVIN | 8541582500 | |
| Buttons | Awpeye | Push-button | |
| C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | ||
| Collagenase 4 | Worthington | CLS4 LS004188 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse | Roche | 11284932001 | |
| Double sided foam tape | SANKA | N/A | |
| Double Sided prototyping circuit board | deyue | N/A | |
| EDTA | Sigma- Aldrich | E7889 | |
| Electrical solder and soldering iron | LDK | 1002P | |
| Electrical Tape | 3M | 03429NA | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 16140089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Graphpad Prism | GraphPad, La Jolla, CA | Graphing and statistical analysis software | |
| Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches | SunFounder | 43237-2 | |
| Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12 | Uxcell | N/A | |
| Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12 | FAS | N/A | |
| Jumper wires (for Arduino Nano) | ELEGOO | EL-CP-004 | |
| LCD screen | JANSANE | N/A | |
| M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12 | Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd |
310luosditaozhuang | |
| M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36 | Still Awake | a52400001 | |
| Quick disconnect terminal connectors | IEUYO | 22010064 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling | 46232 | |
| Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano 12" x 24" | Shenzhen Weiyapuhua Technology |
60-026-3 |
Referencias
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- Wang, J., et al. The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).
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