Механическая диссоциация тканей для анализа одиночных клеток с помощью моторизованного устройства
Summary
Представлен общий протокол комбинированной ферментативной и полуавтоматической механической диссоциации тканей с получением одноклеточных суспензий для последующего анализа, такого как проточная цитометрия. В книгу включены инструкции по изготовлению, сборке и эксплуатации недорогого механического устройства, разработанного для этого протокола.
Abstract
Возможность изолировать и подготавливать отдельные клетки для анализа образцов тканей быстро стала решающей для новых биомедицинских открытий и исследований. Ручные протоколы для изоляции отдельных клеток отнимают много времени и подвержены изменчивости пользователя. Автоматизированные механические протоколы способны сократить время обработки и вариабельность образцов, но они не являются легкодоступными или экономически эффективными в условиях исследований с ограниченными ресурсами. Описанное здесь устройство было разработано для полуавтоматической диссоциации тканей с использованием коммерчески доступных материалов в качестве недорогой альтернативы для академических лабораторий. Приведены инструкции по изготовлению, сборке и эксплуатации конструкции устройства. Протокол диссоциации надежно позволяет получать одноклеточные суспензии с сопоставимым выходом клеток и жизнеспособностью образца с ручным приготовлением в нескольких тканях мыши. Протокол обеспечивает возможность одновременной обработки до 12 образцов тканей на одно устройство, что делает исследования, требующие больших размеров выборки, более управляемыми. Сопутствующее программное обеспечение также позволяет настраивать протокол устройства для адаптации к различным тканям и экспериментальным ограничениям.
Introduction
Анализ отдельных клеток быстро приобрел решающее значение для новых биомедицинских открытий, будь то такие приложения, как проточная цитометрия, идентификация различных типов клеток, секвенирование отдельных клеток или выявление геномных или транскриптомных вариациймежду клетками. Для выделения таких клеток из интересующих тканей необходимо измельчить рассеченные ткани и пропустить их через мелкое клеточное ситечко, чтобы отфильтровать соединительную ткань из нужных клеток (рис. 1А). Выделение адгезивных типов клеток, таких как дендритные клетки или макрофаги, или клетки из особо волокнистых тканей, требует дополнительных этапов механического или ферментативного разделения 2,3,4. Этот процесс, как правило, выполняется вручную, что делает его очень трудоемким и подверженным изменчивости пользователя при оценке выхода клеток и жизнеспособности образцов. Поэтому крайне важно внедрить настраиваемые опции для автоматизированной диссоциации тканей. Несмотря на то, что были предприняты некоторые попытки спроектировать такие системы, существующие варианты не всегда легко доступны, особенно в академических лабораториях и странах с ограниченными ресурсами, в основном из-за непомерно дорогого характераэтих устройств. Кроме того, эти устройства не всегда могут быть адаптированы к индивидуальным потребностям исследовательской группы6.
Здесь было разработано устройство диссоциатора тканей для автоматизации переваривания целых тканей или кусочков тканей в одноклеточные суспензии с помощью пищеварительных ферментов и механического разрушения. Это устройство может быть легко собрано в лаборатории, помещено в нагревательные или охлаждающие камеры для регулирования температуры, настроено на необходимое количество тканей для диссоциации и запрограммировано с помощью желаемых протоколов диссоциации. Широкое использование этого устройства может значительно улучшить воспроизводимость протоколов экстракции клеток и обеспечить экономящую время альтернативу ручной диссоциации.
Конструкция позволяет одновременно расщеплять до 12 тканей с помощью автоматизированного процесса. Устройство состоит из 12 отдельных двигателей, подключенных параллельно и питаемых от стандартной розетки через адаптер переменного/постоянного тока с регулируемым регулятором напряжения для управления вращением/скоростью двигателей. Двигатели поворачивают болт с шестигранной головкой, который плотно входит в верхнюю часть С-образных трубок. С-образные трубки удерживаются на месте за счет натяжения вниз на акриловой пластине, которая защелкивается с обеих сторон к верхней пластине, где закреплены двигатели (Рисунок 1B). Поскольку двигатели подключены параллельно, их скорость при любом заданном напряжении не должна сильно меняться, но нагрузка (количество С-образных трубок, установленных на устройстве) будет влиять на скорость, даже если напряжение поддерживается постоянным. Для измерения оборотов в минуту (об/мин) был встроен тахометр с датчиком Холла и неподвижным магнитом на одном из валов двигателя (дополнительный рисунок 1). Файлы САПР для построения массивов двигателей приведены в Дополнительном файле кодирования 1. Также в комплект входит программируемый переключатель для изменения направления вращения путем изменения местами положительных/отрицательных зарядов, подаваемых на двигатели. Все эти функции интегрированы с помощью закодированного программного обеспечения (программное обеспечение Arduino IDE, см. Таблицу материалов) на Arduino Nano (Дополнительный файл кодирования 2). С помощью подключенных кнопок и ЖК-панели (дополнительный рисунок 2) можно создавать и запускать сохраненные и пользовательские протоколы, автоматически менять направление вращения в заданное время протокола, регулировать скорость с помощью напряжения (дополнительный рисунок 3) и отображать текущую скорость двигателя и время, оставшееся до завершения запрограммированного протокола (дополнительный рисунок 4).
Для настоящего исследования одноклеточные суспензии были приготовлены с использованием как механической ферментативной диссоциации тканей с помощью этого устройства, так и ручно-ферментативной диссоциации тканей для определения различий, если таковые имеются, в клетках, извлеченных для последующего применения. Клеточные препараты оценивали на основе общего выхода клеток на ткань и процента жизнеспособности клеток. Для сравнения различий потенциалов в экспрессии поверхностных маркеров использовали проточную цитометрию. Данные анализировались с помощью программного обеспечения для построения графиков и статистического анализа. Для сравнения пар образцов или групп использовались непарные t-критерии Уэлча, при этом размеры выборки от > 4 мышей представляли собой 2 повторных эксперимента. Подробные инструкции по изготовлению и сборке этого устройства можно найти в Дополнительном файле 1. Материалы, необходимые для этого протокола, перечислены в Таблице материалов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это устройство было разработано для легкой сборки в исследовательских условиях для получения одноклеточных суспензий из цельных тканей для последующего анализа отдельных клеток. Эти функции, хотя и являются базовыми, достаточны для удовлетворения потребностей исследователей в акад?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование было получено от Департамента биоинженерии Фишелла (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Foundation (KM) и Американской ассоциации легких (KM). Авторы благодарят Микеле Калузенски за помощь в редактировании.
Materials
| ¼ inch acrylic sheet 12" x 24" | Acrylic Mega Store | N/A | |
| ½ inch acrylic sheet 12" x 12" | SimbaLux | SL-AS13-12×12 | |
| 12 G stainless steel wire (for tension arms) | Everbilt | 1000847413 | |
| 16 G electrical wire (stranded) | Best Connections | N/A | |
| 2 x 3 mm magnet | SU-CRO0587 | N/A | |
| 2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors) | AEDIKO | AE06233 | |
| 37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12 | Greartisan | N/A | Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included) |
| AC/C Power Adapter with variable voltage controller (5 Amps, 3-12 volts) | Mo-gu | J19091-2-MG-US | |
| AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer | Walfront | 1A | (power adapter for powering Arduino Nano) |
| Arduino Nano (Lafvin) | LAFVIN | 8541582500 | |
| Buttons | Awpeye | Push-button | |
| C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | ||
| Collagenase 4 | Worthington | CLS4 LS004188 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse | Roche | 11284932001 | |
| Double sided foam tape | SANKA | N/A | |
| Double Sided prototyping circuit board | deyue | N/A | |
| EDTA | Sigma- Aldrich | E7889 | |
| Electrical solder and soldering iron | LDK | 1002P | |
| Electrical Tape | 3M | 03429NA | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 16140089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Graphpad Prism | GraphPad, La Jolla, CA | Graphing and statistical analysis software | |
| Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches | SunFounder | 43237-2 | |
| Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12 | Uxcell | N/A | |
| Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12 | FAS | N/A | |
| Jumper wires (for Arduino Nano) | ELEGOO | EL-CP-004 | |
| LCD screen | JANSANE | N/A | |
| M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12 | Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd |
310luosditaozhuang | |
| M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36 | Still Awake | a52400001 | |
| Quick disconnect terminal connectors | IEUYO | 22010064 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling | 46232 | |
| Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano 12" x 24" | Shenzhen Weiyapuhua Technology |
60-026-3 |
Referencias
- Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material. Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).
- Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Rittié, L. Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells. Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).
- Wang, J., et al. The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).
- Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).
- McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells. Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).
- Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells. Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).
- Maisel, K., et al. Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation. Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).
- Karmakar, T., et al. A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).
- Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).
- Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. Carpal tunnel syndrome: a review of literature. Cureus. 12 (3), e7333 (2020).
