מטריצת קרום מרתף צבירת תאים עטופה לחקר היווצרות רקמת טחול מורין

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול לצבירה ומעטפת של תאי טחול בתוך מטריצת קרום מרתף מוצקה למחצה. מבני מטריצת קרום מרתף יכולים לשמש בתרבית תלת ממדית לחקר התפתחות אורגנואידים, או למחקרי השתלות in vivo והתחדשות רקמות.

Abstract

הטחול הוא איבר חיסוני הממלא תפקיד מפתח בתגובות חיסוניות המועברות בדם. אובדן אנטומי או פונקציונלי של רקמה זו מגביר את הרגישות לזיהומים חמורים בדם ואלח דם. השתלה אוטומטית של פרוסות טחול שימשה קלינית להחלפת רקמות שאבדו ולשיקום תפקוד מערכת החיסון. עם זאת, המנגנון המניע התחדשות חזקה ומתפקדת אימונולוגית של רקמת הטחול לא הובהר במלואו. כאן, אנו שואפים לפתח שיטה לצבירה ומעטפת של תאי טחול בתוך מטריצה מוצקה למחצה על מנת לחקור את הדרישות התאיות להיווצרות רקמת הטחול. מבני תאים עטופים במטריצת קרום מרתף מקובלים הן על תרבית רקמת מבחנה של אורגנואידים תלת מימדיים והן על השתלה תחת קפסולת הכליה כדי להעריך ישירות את היווצרות רקמת vivo . על ידי מניפולציה של תאי הקלט לצורך צבירה ואנקפסולציה, אנו מראים כי תאי סטרומה ילודים PDGFRβ⁺MAdCAM-1^– שמקורם בשתלים נדרשים להתחדשות רקמת הטחול תחת מודלים של השתלות בעלי חיים.

Introduction

קרע טראומטי של הטחול והופעת גושים טחול מרובים בגוף היה אחד הסימנים הראשונים לכך שרקמת הטחול הייתה בעלת יכולת התחדשות ^1,2. השתלות אוטומטיות של טחול הוכנסו מאוחר יותר למרפאה כדי לשמר את רקמת הטחול בחולים הזקוקים לכריתת טחול דחופה³. עם זאת, למרות היותו חלק מהפרקטיקה הקלינית במשך עשרות שנים, מעט מאוד ידוע על האופן שבו הטחול מתחדש. מודלים להשתלות בעלי חיים סיפקו תובנה לגבי פרמטרים רבים של התחדשות הטחול ותפקוד מערכת החיסון ^4,5. בפרט, שינויים ניסיוניים בשיטת הכנת השתל אפשרו להתחדשות רקמות להיחקר בפירוט רב יותר ברמה התאית והמולקולרית.

השתלות המערבות פרוסות טחול שלמות עוברות שלב של נמק המוני לפני שמבנה טחול חדש נבנה מחדש⁶. השלב הראשוני של נמק השתל מצביע על כך שרוב הרקמה המושתלת מורכבת בעיקר מתאי דם אדומים ולבנים והיא מיותרת להתחדשות הטחול. זה נחקר באופן ניסיוני על ידי אי הכללת תאים hematopoietic משתלי טחול לפני ההשתלה תחת כמוסת הכליה עכבר. כאן, החלק שאינו לויקוציטים / לא אריתרוציטים של הטחול, הכולל תאי סטרומה ואנדותל, הוכח כמספיק כדי לגרום להיווצרות רקמת דה נובו ⁷. רקמת סטרומה של הטחול יכולה להיות מעובדת עוד יותר לתרחיף של תא יחיד, מה שיאפשר שימוש בטכנולוגיות מיון תאים כדי לתפעל את הרכב השתל התאי. על ידי הסרה סלקטיבית של סוגי תאים מועמדים, זוהו שתי אוכלוסיות ^{תאי סטרומה} CD45-TER-119 שהיו חיוניות לפיתוח שתלים: אוכלוסיית תאים דמוית אנדותל CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ ואוכלוסיית תאים מזנכימליים PDGFRβ⁺ מוגדרת באופן רחב יותר⁸.

בניית שתלים מתאי הטחול משתנה מבחינת חומרי תמיכה ותהליכי העמסת תאים. טחול מהונדס רקמות הוכנו בעבר על ידי העמסת יחידות ספלניות על פיגום פולימרי חומצה פוליגליקולית/חומצה לקטית^{פולי-L 5,9}. באופן מעניין, תאי סטרומה של הטחול שנספגו בספוג קולגן לא הצליחו להיקלט, בעוד שתאי סטרומה שהצטברו והועמסו על יריעת קולגן סייעו להתחדשות הטחול⁸. השעיה של תאי סטרומה בטחול בתוך מטריצת מטריג’ל הוכחה גם כגורמת לצבירת תאים בתנאי תרבית תלת ממדית¹⁰. עם זאת, שיטה זו לא נבדקה לשימוש במודלים להשתלה. המטרה הכוללת של הפרוטוקול הנוכחי היא לצבור ולעטוף בכוח תאי סטרומה של הטחול ישירות בתוך מטריצת קרום המרתף, אשר לאחר מכן יכולים להיות מועברים למערכת תלת-ממדית של תרביות רקמה חוץ גופית או לשמש ככלי להשתלות מודל של בעלי חיים (איור משלים 1).

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים נערכו על פי פרוטוקולים ניסיוניים שאושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת קווינסלנד (UQBR/079/19). 1. איסוף רקמות והכנת תאי סטרומה יש להרדים עכברים תורמי יילודים בני 0.5-1.5 יום ו/או נקבה BALB/c על ידי השראת היפותרמיה על ידי עטיפת בעלי חיים ?…

Representative Results

צבירת תאים חשובה לקידום מגע ואיתות בין תאים. עטיפת צברי תאים בתוך מטריצת קרום המרתף תמכה בשתי התרביות התלת-ממדיות ליצירת אורגנואידים של רקמת מבחנה והקלה על העברה מכנית של תאים לתוך קפסולת הכליה להשתלת שתל. כדי לבסס מבנים אלה, מטריצת קרום המרתף נשמרה תחילה במצב נוזלי בתנאים קרים כקרח. ?…

Discussion

הצבירה של תאי טחול בילודים בתוך תווך מוצק למחצה מייצגת שיטה בת קיימא ליצירת מבני טחול. פרוטוקולים דומים מבוססי ממברנות מרתף שימשו ליזום תרביות טחול תלת ממדיות¹⁰. כאן, אנו מראים כי מבני הטחול מתאימים באותה מידה למערכות תרבית אורגנואידים במבחנה , כמו גם למודלים של השתלת in …

Materials

96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm