Инкапсулированная агрегация клеток матрицы базальной мембраны для исследования формирования ткани селезенки мышей
Summary
В данной статье описывается протокол агрегации и инкапсуляции клеток селезенки в полутвердой мембранной матрице. Матричные конструкции базальной мембраны могут быть использованы в трехмерной культуре для изучения развития органоидов или для трансплантации in vivo и исследований регенерации тканей.
Abstract
Селезенка является иммунным органом, который играет ключевую роль в иммунных реакциях, передающихся через кровь. Анатомическая или функциональная потеря этой ткани повышает восприимчивость к тяжелым инфекциям крови и сепсису. Аутотрансплантация срезов селезенки используется клинически для замещения утраченной ткани и восстановления иммунной функции. Однако механизм, приводящий к устойчивой и иммунологически функциональной регенерации тканей селезенки, до конца не выяснен. Здесь мы стремимся разработать метод агрегации и инкапсуляции клеток селезенки в полутвердом матриксе, чтобы исследовать клеточные потребности для формирования ткани селезенки. Инкапсулированные клеточные конструкции базальной мембранной матрицы поддаются как культивированию трехмерных органоидов in vitro, так и трансплантации под капсулу почки для непосредственной оценки образования ткани in vivo. Манипулируя входными клетками для агрегации и инкапсуляции, мы демонстрируем, что полученные из трансплантата PDGFRβ+MAdCAM-1-неонатальные стромальные клетки необходимы для регенерации ткани селезенки в моделях трансплантации животных.
Introduction
Травматический разрыв селезенки и появление множественных селезеночных узелков в организме был одним из первых признаков того, что ткань селезенки обладает регенеративной способностью 1,2. Позже в клинику была внедрена аутотрансплантация селезенки для сохранения ткани селезенки у пациентов, нуждающихся в экстренной спленэктомии3. Тем не менее, несмотря на то, что селезенка является частью клинической практики на протяжении десятилетий, очень мало известно о том, как селезенка регенерирует. Модели трансплантации животных позволили получить представление о многих параметрах регенерации селезенки и иммунной функции 4,5. В частности, экспериментальные модификации метода препарирования трансплантата позволили более детально изучить регенерацию тканей на клеточном и молекулярном уровне.
Трансплантация с использованием целых срезов селезенки проходит фазу массового некроза, прежде чем будет восстановлена новая структура селезенки6. Начальная фаза некроза трансплантата говорит о том, что основная масса трансплантированной ткани в значительной степени состоит из эритроцитов и лейкоцитов и не нужна для регенерации селезенки. Это было исследовано экспериментально путем исключения гемопоэтических клеток из трансплантатов селезенки перед трансплантацией под капсулу почки мыши. Здесь было показано, что нелейкоцитарная/неэритроцитарная фракция селезенки, которая включает стромальные и эндотелиальные клетки, достаточна для индуцирования образования de novo ткани7. Стромальная ткань селезенки может быть дополнительно переработана в одноклеточную суспензию, что позволяет использовать технологии сортировки клеток для манипулирования составом клеточного трансплантата. Путем селективного удаления типов клеток-кандидатов были идентифицированы две популяции CD45-TER-119-стромальных клеток, которые были необходимы для развития трансплантата: эндотелиоподобная популяция клеток CD31+CD105+MAdCAM-1+ и более широко определенная популяция мезенхимальных клеток PDGFRβ+ 8.
Конструкция трансплантатов из клеток селезенки различается с точки зрения вспомогательных материалов и процессов загрузки клеток. Тканеинженерные селезенки ранее были получены путем загрузки селезеночных единиц на полимерный каркас из полигликолевой кислоты/поли-L молочной кислоты 5,9. Интересно, что стромальные клетки селезенки, абсорбированные в коллагеновую губку, не приживались, в то время как стромальные клетки, агрегированные и нагруженные на коллагеновый лист,способствовали регенерации селезенки8. Также было продемонстрировано, что ресуспензия стромальных клеток селезенки внутри матрикса Matrigel индуцирует агрегацию клеток в трехмерных условиях культивирования10. Однако этот метод не был протестирован для использования в трансплантационных моделях. Общая цель текущего протокола заключается в принудительной агрегации и инкапсуляции стромальных клеток селезенки непосредственно внутри матрицы базальной мембраны, которые впоследствии могут быть перенесены в трехмерную систему культивирования тканей in vitro или использованы в качестве средства для трансплантации модельных животных (дополнительный рисунок 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Агрегация клеток селезенки новорожденных в полутвердой среде представляет собой жизнеспособный метод создания селезеночных конструкций. Аналогичные протоколы на основе базальной мембраны были использованы для инициирования трехмерных культур селезенки10. Здесь мы дем?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии (#GNT1078247).
Materials
| 96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes | Corning | CLS4401 | For placing inside a 14 ml conical tube |
| B-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Stock 55 mM, use at 50 uM |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | From Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | Sigma-Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | 4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered |
| Eclipse 200 μl Pipette Tips | Labcon | 1030-260-000 | Bevel Point |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | Lot# 1382243 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Stock 100X, use at 1X |
| Matrigel | Corning | 354263 | Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186 |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140076 | Stock 100X, use at 1X |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin |
| Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27216 | 70 μm |
| Ring Tweezers | NAPOX | A-26 | Ring size: 3 mm |
| Rock Inhibitor (Y-27632) | MedChemExpres | HY-10071 | |
| Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge | Thermofisher | Acceleration and deceleration speeds were set to 8 | |
| Ultra Fine Tweezers | EMS | 78340-51S | Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish. |
| Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel | Ethicon | J283G | |
| Wiretrol II Long Wire Plunger | Drummond | 5-000-2002-L | Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long |
| Wound Clip Applier | MikRon | 427630 | |
| Wound Clips | MikRon | 427631 | 9 mm |
Referencias
- Jarcho, S., Andersen, D. Traumatic autotransplantation of splenic tissue. American Journal of Pathology. 15 (5), 527-546 (1939).
- Storsteen, K. A., ReMine, W. Rupture of the spleen with splenic implants: splenosis. Annals of Surgery. 137 (4), 551-557 (1953).
- Mizrahi, S. Posttraumatic autotransplantation of spleen tissue. Archives of Surgery. 124 (7), 863 (1989).
- Miko, I., et al. Spleen autotransplantation. Morphological and functional follow-up after spleen autotransplantation in mice: A research summary. Microsurgery. 27 (4), 312-316 (2007).
- Grikscheit, T. C., et al. Tissue-engineered spleen protects against overwhelming Pneumococcal sepsis in a rodent model. Journal of Surgical Research. 149 (2), 214-218 (2008).
- Pabst, R., Westermann, J., Rothkotter, H. Immunoarchitecture of regenerated splenic and lymph node transplants. International Review of Cytology. 128, 215-260 (1991).
- Tan, J. K. H., Watanabe, T. Murine spleen tissue regeneration from neonatal spleen capsule requires lymphotoxin priming of stromal cells. The Journal of Immunology. 193 (3), 1194-1203 (2014).
- Tan, J. K. H., Watanabe, T. Stromal cell subsets directing neonatal spleen regeneration. Scientific Reports. 7 (1), 40401 (2017).
- Gee, K., et al. Spleen organoid units generate functional human and mouse tissue-engineered spleen in a murine model. Tissue Engineering Part A. 26 (7-8), 411-418 (2020).
- Ueno, Y., et al. Transcription factor Tlx1 marks a subset of lymphoid tissue organizer-like mesenchymal progenitor cells in the neonatal spleen. Scientific Reports. 9 (1), 20408 (2019).
- . Online data repository: Matrigel encapsulated cell aggregation for investigating murine spleen tissue formation Available from: https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01 (2023)
