Aggregazione cellulare incapsulata della matrice della membrana basale per lo studio della formazione del tessuto milza murino

Summary

Questo articolo descrive un protocollo per l’aggregazione e l’incapsulamento delle cellule della milza all’interno di una matrice di membrana basale semisolida. I costrutti di matrice di membrana basale possono essere utilizzati in coltura tridimensionale per lo studio dello sviluppo di organoidi o per studi di trapianto e rigenerazione tissutale in vivo .

Abstract

La milza è un organo immunitario che svolge un ruolo chiave nelle risposte immunitarie trasmesse per via ematica. La perdita anatomica o funzionale di questo tessuto aumenta la suscettibilità a gravi infezioni del sangue e sepsi. L’autotrapianto di fette di milza è stato utilizzato clinicamente per sostituire il tessuto perso e ripristinare la funzione immunitaria. Tuttavia, il meccanismo che guida la rigenerazione del tessuto della milza robusto e immunologicamente funzionale non è stato completamente chiarito. Qui, miriamo a sviluppare un metodo per aggregare e incapsulare le cellule della milza all’interno di una matrice semi-solida al fine di studiare i requisiti cellulari per la formazione del tessuto della milza. I costrutti cellulari incapsulati con matrice di membrana basale sono suscettibili sia di coltura tissutale in vitro di organoidi tridimensionali che di trapianto sotto la capsula renale per valutare direttamente la formazione di tessuti in vivo . Manipolando le cellule di input per l’aggregazione e l’incapsulamento, dimostriamo che le cellule stromali neonatali PDGFR⁺MAdCAM-1^– derivate da innesto sono necessarie per la rigenerazione del tessuto della milza in modelli di trapianto animale.

Introduction

La rottura traumatica della milza e la comparsa di noduli splenici multipli nel corpo è stata una delle prime indicazioni che il tessuto della milza ospitava capacità rigenerativa ^1,2. Gli autotrapianti di milza sono stati successivamente introdotti in clinica per preservare il tessuto della milza nei pazienti che necessitavano di splenectomia d’urgenza³. Eppure, nonostante faccia parte della pratica clinica da decenni, si sa molto poco su come si rigenera la milza. I modelli di trapianto animale hanno fornito informazioni su molteplici parametri della rigenerazione della milza e della funzione immunitaria ^4,5. In particolare, le modifiche sperimentali al metodo di preparazione dell’innesto hanno permesso di studiare in modo più dettagliato la rigenerazione tissutale a livello cellulare e molecolare.

I trapianti che coinvolgono fette intere di milza subiscono una fase di necrosi di massa prima che venga ricostruita una nuova struttura della milza⁶. La fase iniziale della necrosi del trapianto suggerisce che la maggior parte del tessuto trapiantato è costituito in gran parte da globuli rossi e bianchi e non è necessario per la rigenerazione della milza. Questo è stato studiato sperimentalmente escludendo le cellule ematopoietiche da innesti di milza prima del trapianto sotto la capsula renale di topo. In questo caso, la frazione non leucocitaria/non eritrocitaria della milza, che comprende le cellule stromali ed endoteliali, si è dimostrata sufficiente per indurre la formazione di tessuto de novo ⁷. Il tessuto stromale della milza potrebbe essere ulteriormente trasformato in una sospensione a singola cellula, consentendo l’uso di tecnologie di selezione cellulare per manipolare la composizione dell’innesto cellulare. Rimuovendo selettivamente i tipi di cellule candidate, sono state identificate due popolazioni di cellule stromali CD45-TER-119^– indispensabili per lo sviluppo del trapianto: una popolazione di cellule CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ di tipo endoteliale e una popolazione di cellule mesenchimali PDGFRβ⁺ più ampiamente definita⁸.

La costruzione degli innesti da cellule di milza varia in termini di materiali di supporto e processi di caricamento delle cellule. Le milze ingegnerizzate con tessuti sono state precedentemente preparate caricando unità spleniche su uno scaffold polimerico di acido poliglicolico/acido poli-lattico ^5,9. È interessante notare che le cellule stromali della milza assorbite in una spugna di collagene non sono riuscite ad attecchire, mentre le cellule stromali aggregate e caricate su un foglio di collagene hanno facilitato la rigenerazione della milza⁸. È stato anche dimostrato che la risospensione delle cellule stromali della milza all’interno di una matrice di Matrigel induce l’aggregazione cellulare in condizioni di coltura tridimensionale¹⁰. Tuttavia, questo metodo non è stato testato per l’uso in modelli di trapianto. L’obiettivo generale dell’attuale protocollo è quello di aggregare e incapsulare forzatamente le cellule stromali della milza direttamente all’interno della matrice di membrana basale, che successivamente possono essere trasferite in un sistema di coltura tissutale tridimensionale in vitro o utilizzate come veicolo per trapianti su modelli animali (Figura 1 supplementare).

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte secondo protocolli sperimentali approvati dal Comitato Etico Animale dell’Università del Queensland (UQBR/079/19). 1. Raccolta del tessuto e preparazione delle cellule stromali Sopprimere topi donatori neonatali maschi e/o femmine di 0,5-1,5 giorni di età mediante induzione dell’ipotermia avvolgendo gli animali all’interno della carta velina e mettendoli sotto il ghiaccio tritato per >10 minuti.NOTA: Questo p…

Representative Results

L’aggregazione cellulare è importante per promuovere il contatto e la segnalazione cellula-cellula. L’incapsulamento di aggregati cellulari all’interno della matrice di membrana basale ha supportato sia le colture tridimensionali per la formazione di organoidi tissutali in vitro che ha facilitato la consegna meccanica delle cellule nella capsula renale per il trapianto di innesto. Per stabilire questi costrutti, la matrice di membrana basale è stata prima mantenuta in uno stato fluidico in condizioni di freddo…

Discussion

L’aggregazione di cellule neonatali della milza all’interno di un mezzo semisolido rappresenta un metodo praticabile per generare costrutti di milza. Protocolli simili basati sulla matrice della membrana basale sono stati utilizzati per avviare colture tridimensionali di milza¹⁰. Qui, dimostriamo che i costrutti di milza sono ugualmente suscettibili di sistemi di coltura di organoidi in vitro e di modelli di trapianto in vivo . Da notare che il trapianto di organoidi di milza col…

Materials

96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm