使用激光光镊操纵隔离神经细胞在体外
Summary
本视频介绍了使用激光镊子在体外培养的神经元的操纵。
Abstract
在这个文件和视频，我们描述了在我们的实验室中使用的协议，成人视网膜神经细胞在体外再生的细胞过程的研究目标的喜好。视网膜细胞培养的准备程序开始的解剖，消化和视网膜trituration，并结束孤立的视网膜细胞，制成的菜肴，尤其是使用激光镊子电镀。这些菜都分为一个的细胞粘附半和细胞防护剂一半。细胞的粘着面涂上一层SAL – 1抗体，我们的细胞生长提供了一个基板。其他胶粘剂基材，可用于其他类型的细胞。细胞防护剂侧涂有一层薄薄的聚HEMA。镀上的菜的聚甲基丙烯酸羟乙酯方的细胞被困激光镊子，运输，然后放在相邻SAL – 1侧到一个单元格，以创建一对。任何规模的细胞群的形成，应尽可能使用这种技术。 “激光镊子控制显微”的手段，调查人员可以选择移动的细胞和细胞之间的距离可以标准化。由于激光束通过透明培养皿的表面，细胞的选择和安置在一个封闭的，无菌的环境。细胞可以通过视频监控时间推移和使用所需的任何细胞生物学技术。这种技术可以帮助细胞间的相互作用的调查。
Protocol
光镊操纵分离的细胞在培养 光镊捕获势力产生的光的势头（Ashkin，1991年;。Ashkin等，1986） 。虽然这些势力很容易陷阱细胞悬浮液中，他们无法将坚持到表面的细胞。 因此，减少粘附在培养皿中的细胞被困点，聚- 2 – hydroxyethylmethacrylate（聚甲基丙烯酸羟乙酯）（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州），与细胞的驱蚊剂无毒复合涂层的盖玻片以前受聘为内…
Discussion
光有气势，当光线折射，因为它通过细胞传递，一种力量是需要改变方向的势头。反过来，由于动量守恒定律，在相反方向的力量，必须在反应上一个单元格。 Ashkin（1991）表明，显微镜物镜聚焦的激光束产生的力将走向一个细胞，社会关注的焦点。尽管激光束产生只有几piconewtons武力，这股力量足以渡过难关中的单元格。甚少被水吸收的近红外波长是用于细胞（刘等，1995），以避免损坏。在我们的实验室中使?…
Acknowledgements
研究是由美国国立卫生研究院资助EY012031和EY0182175和FM柯比基金会的支持。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR Scientific Inc., Westchester, PA | 48380 080 | ||
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Chemical Co., St Louis, MO | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol | |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International, Temecula CA | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use | |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | ||
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning Inc., Corning NY | 7078A-5 | ||
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning inc., Corning NY | 430165 | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning Corp., Midland MI | |||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | |||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | Numerical aperture (N.A. 1.3) | ||
| Black and white CCD camera | Sony Corporation, Tokyo, Japan | |||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
Referencias
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
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Clarke, R., Wang, J., Townes-Anderson, E. Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro. J. Vis. Exp. (19), e911, doi:10.3791/911 (2008).