בעזרת פינצטה לייזר עבור מניפולציה נוירונים מבודד במבחנה
Summary
וידאו זה מתאר את המניפולציה של נוירונים בתרבית באמצעות לייזר פינצטה במבחנה.
Abstract
במאמר זה ווידאו, אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים במעבדה שלנו ללמוד את העדפות המיקוד של תהליכי התחדשות התא של הנוירונים ברשתית מבוגר במבחנה. נהלים להכנת תרביות תאים ברשתית להתחיל עם לעיכול נתיחה, טחינה דקה של הרשתית, ולסיים עם ציפוי של תאים ברשתית מבודדת על הכלים שנעשו במיוחד לשימוש עם פינצטה לייזר. מאכלים אלה מחולקים חצי תא דבק וחצי דוחה התא. הצד דבק התא מצופה בשכבה של סאל-1 נוגדנים, המספקים המצע שעליו גדלים התאים שלנו. מצעים דבק אחר יוכל לשמש עבור סוגי תאים אחרים. הצד דוחה התא מצופה בשכבה דקה של פולי-המה. התאים מצופה בצד מרובה המה המנה לכודים עם פינצטה לייזר, מועבר ואז להציב סמוך לתא בצד סאל-1 כדי ליצור זוג. כינונה של קבוצות תאים בכל גודל צריך להיות אפשרי עם טכניקה זו. "לייזר פינצטה שבשליטת המיקרומניפולציה" אומר החוקר יכול לבחור אילו תאים להעביר את המרחק הרצוי בין תאים יכול להיות סטנדרטית. כיוון את קרן הלייזר עוברת משטחים שקופים של המנה תרבות, בחירת מיקום התא נעשים בסביבה, סגורה סטרילית. תאים יכול להיות פיקוח על ידי וידאו זמן לשגות בשימוש עם טכניקה כל תא ביולוגי הנדרש. טכניקה זו עשויה לסייע בחקירות של תאים תאים אינטראקציות.
Protocol
Discussion
Light יש מומנטום, וכאשר קרן האור נשבר כשהוא עובר דרך תא, כוח נדרש כדי לשנות את כיוון המומנטום. בגלל חוק שימור התנע, כוח בכיוון ההפוך חייב, בתורו, להגיב בחזרה לתא. Ashkin (1991) הראה כי הכוח שנוצר על ידי קרן לייזר ממוקדת על ידי עדשה מיקרוסקופ המטרה יעברו תא לעבר מרכז המיקוד. אף על פי קרן לייזר…
Acknowledgements
המחקר נתמך על ידי NIH מענקים EY012031 ו EY0182175 ואת קירבי FM קרן.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR Scientific Inc., Westchester, PA | 48380 080 | ||
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Chemical Co., St Louis, MO | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol | |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International, Temecula CA | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use | |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | ||
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning Inc., Corning NY | 7078A-5 | ||
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning inc., Corning NY | 430165 | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning Corp., Midland MI | |||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | |||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | Numerical aperture (N.A. 1.3) | ||
| Black and white CCD camera | Sony Corporation, Tokyo, Japan | |||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
Referencias
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
