Использование лазерный пинцет для манипуляций Изолированные нейроны In Vitro
Summary
Это видео описывает манипуляции культурный нейронов помощью лазерного пинцета в пробирке.
Abstract
В данной работе и видео, мы описываем протоколов, используемых в нашей лаборатории для изучения ориентации предпочтения регенерации клеточных процессов взрослых нейронов сетчатки в пробирке. Порядок подготовки сетчатки клеточных культурах начинается с рассечение, пищеварения и растирания сетчатки, а в конце покрытия изолированных клеток сетчатки на блюда, приготовленные специально для использования с лазерным пинцетом. Эти блюда делятся на половину ячейки клей с половиной ячейки репеллент. Стороны ячейки клей покрыта слоем Сал-1 антител, которые обеспечивают подложки, на которой наши клетки расти. Другие клей подложки могут быть использованы для других типов клеток. Стороны ячейки репеллент покрыта тонким слоем поли-НЕМА. Клетки высевали на поли-НЕМА стороне блюда оказались в ловушке с лазерным пинцетом, транспортировались и затем помещается рядом с ячейкой на Сал-1 стороной для создания пары. Формирование группы клеток любого размера должно быть возможным с этой техникой. "Лазерный пинцет контролируемых микроманипуляция" означает, что исследователь может выбрать, какие клетки необходимо переместить, и необходимое расстояние между клетками может быть стандартизирована. Поскольку лазерный луч проходит через прозрачную поверхность культуры блюдо, выбора ячейки и размещение делается в закрытых, стерильной среде. Клетки могут контролироваться с помощью видео покадровой и использовать с любой клетки биологических техники требуется. Эта техника может помочь исследование межклеточных взаимодействий.
Protocol
Discussion
Свет импульс, и, когда световой луч преломляется, проходя через ячейки, сила требуется для изменения направления движения. В силу закона сохранения импульса, силы в противоположном направлении должна, в свою очередь, реагируют обратно на камеру. Ашкина (1991) показали, что сила, создаваемая с помощью …
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке грантов NIH EY012031 и EY0182175 и FM-Кирби Foundation.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR Scientific Inc., Westchester, PA | 48380 080 | ||
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Chemical Co., St Louis, MO | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol | |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International, Temecula CA | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use | |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | ||
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning Inc., Corning NY | 7078A-5 | ||
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning inc., Corning NY | 430165 | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning Corp., Midland MI | |||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | |||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | Numerical aperture (N.A. 1.3) | ||
| Black and white CCD camera | Sony Corporation, Tokyo, Japan | |||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
Referencias
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
