L'aide de pincettes laser pour la manipulation neurones isolés in vitro
Summary
Cette vidéo décrit la manipulation des neurones cultivés en utilisant le laser pincettes in vitro.
Abstract
Dans ce papier et vidéo, nous décrivons les protocoles utilisés dans notre laboratoire pour étudier les préférences de ciblage des processus régénérant cellulaire des neurones rétiniens adultes in vitro. Procédures pour préparer des cultures de cellules rétiniennes commencer par la dissection, la digestion et la trituration de la rétine, et se terminent avec le placage de cellules rétiniennes isolées sur des plats spécialement conçus pour une utilisation avec pinces optiques. Ces plats sont divisés en une demi adhésion cellulaire et demi répulsif cellule. Le côté adhésif cellule est recouverte d'une couche de Sal-1 anticorps, qui fournissent un substrat sur lequel les cellules de notre croissance. D'autres substrats adhésif pourrait être utilisé pour d'autres types cellulaires. Le côté répulsif cellule est recouverte d'une fine couche de poly-HEMA. Les cellules étalées sur le côté poly-HEMA du plat sont piégés avec la pince à épiler au laser, transporté et placé à proximité d'un cellulaire sur la Sal-1 côté pour créer une paire. Formation des groupes de cellules de n'importe quelle taille devrait être possible avec cette technique. «Laser-pincette contrôlée micromanipulation» signifie que le chercheur peut choisir lequel les cellules à se déplacer, et la distance souhaitée entre les cellules peuvent être standardisés. Parce que le faisceau laser passe à travers des surfaces transparentes de la boîte de culture, la sélection de cellules et de placement sont effectués dans un espace clos, environnement stérile. Les cellules peuvent être surveillés par vidéo time-lapse et utilisé avec n'importe quelle technique de biologie cellulaire nécessaires. Cette technique peut aider les enquêtes sur les interactions cellule-cellule.
Protocol
Discussion
La lumière a l'élan, et quand un rayon de lumière est réfractée lorsqu'elle passe à travers une cellule, une force est nécessaire pour changer la direction de l'élan. En raison de la loi de conservation de l'élan, une force dans la direction opposée doivent, à leur tour, réagissent à leur tour sur une cellule. Ashkin (1991) ont montré que la force générée par un faisceau laser focalisé par un objectif de microscope se déplace d'une cellule vers le centre d'intérêt. Même si un faisceau laser ne g…
Acknowledgements
La recherche a été financée par des subventions du NIH et de EY012031 EY0182175 et le FM Kirby Fondation.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR Scientific Inc., Westchester, PA | 48380 080 | ||
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Chemical Co., St Louis, MO | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol | |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International, Temecula CA | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use | |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | ||
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning Inc., Corning NY | 7078A-5 | ||
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning inc., Corning NY | 430165 | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning Corp., Midland MI | |||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | |||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | Numerical aperture (N.A. 1.3) | ||
| Black and white CCD camera | Sony Corporation, Tokyo, Japan | |||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
Referencias
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
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- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
